Секвенирование путем лигирования
Секвенирование путем лигирования — это метод секвенирования ДНК , в котором используется фермент ДНК-лигаза для идентификации нуклеотида , присутствующего в заданном положении в последовательности ДНК. В отличие от большинства популярных в настоящее время методов секвенирования ДНК, этот метод не использует ДНК-полимеразу для создания второй цепи. Вместо этого чувствительность фермента ДНК-лигазы к несовпадению используется для определения базовой последовательности целевой молекулы ДНК.
Процесс
[ редактировать ]ДНК-лигаза — фермент , соединяющий концы молекул ДНК. обычно лигаза представляет собой соединение двух пар концов одновременно, как при лигировании фрагментов рестриктазы Хотя , она также может соединять концы только на одной из двух цепей (например, когда другая цепь уже непрерывна или не имеет концевого фосфата). необходимо для перевязки). ДНК-лигаза чувствительна к структуре ДНК и имеет очень низкую эффективность при несовпадении оснований двух цепей.
Секвенирование путем лигирования зависит от чувствительности ДНК-лигазы к несовпадению пар оснований. Молекула-мишень, подлежащая секвенированию, представляет собой одну цепь неизвестной последовательности ДНК, фланкированную по крайней мере на одном конце известной последовательностью. Короткая «якорная» цепь вводится для связывания известной последовательности.
смешанный пул олигонуклеотидов- Затем вносят зондов (длиной восемь или девять оснований), который метят (обычно флуоресцентными красителями) в соответствии с положением, которое будет секвенировано. Эти молекулы гибридизуются с целевой последовательностью ДНК рядом с якорной последовательностью, и ДНК-лигаза предпочтительно присоединяет молекулу к якорю, когда ее основания соответствуют неизвестной последовательности ДНК. На основании флуоресценции молекулы можно сделать вывод об идентичности нуклеотида в этом положении неизвестной последовательности.
Олигонуклеотидные зонды также могут быть сконструированы с расщепляемыми связями, которые можно расщепить после идентификации метки. Это приведет к удалению метки и регенерации 5'-фосфата на конце лигированного зонда, подготавливая систему к следующему раунду лигирования. Этот цикл можно повторить несколько раз для чтения более длинных последовательностей. [1] При этом секвенируется каждое N-е основание, где N — длина зонда, оставшегося после расщепления. Для секвенирования пропущенных положений якорь и лигированные олигонуклеотиды можно удалить из целевой последовательности ДНК и начать еще один раунд секвенирования путем лигирования с якорем на одно или несколько оснований короче.
Более простой, хотя и более ограниченный метод заключается в повторении раундов одной лигации, когда метка соответствует разному положению в зонде, с последующим удалением якоря и лигированием зонда. [2] [3]
Секвенирование путем лигирования может проходить в любом направлении (либо 5'-3', либо 3'-5') в зависимости от того, какой конец олигонуклеотида зонда блокируется меткой. Направление 3'-5' более эффективно для выполнения нескольких циклов лигирования. Обратите внимание, что это противоположное направление методам секвенирования на основе полимеразы.
Ограничения
[ редактировать ]Сообщалось, что такое секвенирование методом лигирования вызывает проблемы с секвенированием палиндромных последовательностей. [4]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ SC Macevicz, патент США 5750341, подан в 1995 г.
- ^ Уайтли (1988). «Обнаружение специфических последовательностей нуклеиновых кислот». Патент США 4883750 .
- ^ Дж. Шендуре, Г. Дж. Поррека, Н. Б. Реппас, К. Лин, Дж. Пе Маккатчеон, А. М. Розенбаум, М. Д. Ван, К. Чжан, Р. Д. Митра и Г. М. Черч (2005). «Точное мультиплексное секвенирование полонии эволюционировавшего бактериального генома» . Наука . 309 (5741): 1728–1732. Бибкод : 2005Sci...309.1728S . дои : 10.1126/science.1117389 . ПМИД 16081699 . S2CID 11405973 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Ю-Фэн Хуан , Шэн-Чунг Чен , Йи-Шиен Чан , Цзы-Хан Чен и Куо-Пин Чиу (2012). «Палиндромная последовательность препятствует механизму секвенирования путем лигирования» . Системная биология BMC . 6 (Дополнение 2): S10. дои : 10.1186/1752-0509-6-S2-S10 . ПМК 3521181 . ПМИД 23281822 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )