Мутагенез с насыщением последовательностей

Мутагенез с насыщением последовательностей ( SeSaM ) — это метод химио-ферментативного случайного мутагенеза, для направленной эволюции белков применяемый и ферментов . ^{[ нужна ссылка ]} Это один из наиболее распространенных методов насыщающего мутагенеза . В ходе четырех ПЦР стадий реакции на основе фосфоротиоатные нуклеотиды вставляются в последовательность гена , расщепляются, а полученные фрагменты удлиняются за счет универсальных или вырожденных нуклеотидов . Эти нуклеотиды затем заменяются стандартными нуклеотидами, что обеспечивает широкое распространение мутаций нуклеиновых кислот по последовательности гена с предпочтением трансверсиям и с уникальным акцентом на последовательные точечные мутации, которые трудно получить с помощью других методов мутагенеза. Методика была разработана профессором Ульрихом Шванебергом из Бременского университета Джейкобса и Ахенского университета RWTH .

Технологии, разработки и преимущества

SeSaM был разработан для преодоления некоторых основных ограничений, возникающих при работе со стандартными методами мутагенеза, основанными на простых методах ПЦР, подверженных ошибкам (эпПЦР). Эти методы эпПЦР основаны на использовании полимераз и, таким образом, сталкиваются с ограничениями, которые в основном возникают из-за того, что только одна, но очень редко последовательная нуклеиновая кислота ^{[ нужна ссылка ]} замены выполняются и что эти замены обычно происходят только в определенных, предпочтительных позициях. Кроме того, трансверсии нуклеиновых кислот гораздо менее вероятны, чем переходы , и требуют специально разработанных полимераз с измененной предвзятостью . ^{[ 1 ]} Эти характеристики катализируемого epPCR обмена нуклеиновых кислот вместе с тем фактом, что генетический код вырождается, уменьшают результирующее разнообразие на уровне аминокислот . Синонимические замены приводят к сохранению аминокислот, или консервативные мутации со схожими физико-химическими свойствами, такими как размер и гидрофобность . широко распространены ^{[ 2 ]}^{[ 3 ]} Путем неспецифического введения универсальных оснований в каждую позицию последовательности гена SeSaM преодолевает смещение полимеразы, благоприятствуя временным заменам в определенных положениях, но открывает полную последовательность гена для разнообразного набора аминокислотных замен. ^{[ 4 ]}

В ходе разработки SeSaM-метода было внесено несколько модификаций, позволивших ввести несколько мутаций одновременно. ^{[ 5 ]} Еще одно продвижение метода было достигнуто за счет введения вырожденных оснований вместо универсального инозина и использования оптимизированных ДНК-полимераз, что еще больше увеличило долю вносимых трансверсий. ^{[ 6 ]} Этот модифицированный метод SeSaM-TV+, кроме того, позволяет и способствует введению двух последовательных нуклеотидных замен, значительно расширяя спектр аминокислот, которые могут быть заменены.

Путем нескольких оптимизаций, включая применение улучшенной химерной полимеразы на этапе III метода SeSaM-TV-II. ^{[ 7 ]}^{[ 8 ]} и добавление альтернативного вырожденного нуклеотида для эффективной замены оснований тимина и цитозина и увеличения частоты мутаций в SeSaM-P/R, ^{[ 9 ]} созданные библиотеки были дополнительно улучшены в отношении количества трансверсий, а количество последовательных мутаций было увеличено до 2–4 последовательных мутаций с частотой последовательных мутаций до 30%. ^{[ 10 ]}

Процедура

Метод SeSaM состоит из четырех этапов ПЦР, которые можно выполнить в течение двух-трех дней. Основные части включают включение фосфоротиоатных нуклеотидов, химическую фрагментацию в этих положениях, введение универсальных или вырожденных оснований и их замену природными нуклеотидами, вызывающими точковые мутации.

Первоначально универсальные последовательности «SeSaM» вставляются с помощью ПЦР с ген-специфичными праймерами, связывающимися перед и позади интересующего гена. Интересующий ген с его фланкирующими областями амплифицируют для введения этих последовательностей SeSaM_fwd и SeSaM_rev и для создания матрицы для последовательных этапов ПЦР.

Эти сгенерированные так называемые матрицы fwd и rev теперь амплифицируются в реакции ПЦР с заранее определенной смесью фосфоротиоата и стандартных нуклеотидов, чтобы гарантировать равномерное распределение вставленных мутаций по всей длине гена. Продукты ПЦР этапа 1 специфически расщепляются по фосфоротиоатным связям, образуя пул одноцепочечных фрагментов ДНК разной длины, начиная с универсального праймера.

На этапе 2 SeSaM одиночные цепи ДНК удлиняются за счет одного или нескольких универсальных или вырожденных оснований (в зависимости от применяемой модификации SeSaM), катализируемых терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TdT). Этот шаг является ключевым шагом для введения характерных последовательных мутаций для случайной мутации целых кодонов.

Затем на этапе 3 выполняется ПЦР, рекомбинирующая одноцепочечные фрагменты ДНК с соответствующей полноразмерной обратной матрицей, генерируя полноразмерный двухцепочечный ген, включающий в свою последовательность универсальные или вырожденные основания.

Путем замены универсальных/вырожденных оснований в последовательности гена случайными стандартными нуклеотидами на этапе 4 SeSaM генерируется разнообразный набор полноразмерных генных последовательностей с замещающими мутациями, включая высокую нагрузку трансверсий и последующих замещающих мутаций.

Приложения

SeSaM используется для непосредственной оптимизации белков на уровне аминокислот, а также для предварительной идентификации положений аминокислот для тестирования насыщающего мутагенеза на предмет идеального аминокислотного обмена. SeSaM успешно применялся в многочисленных кампаниях по направленной эволюции различных классов ферментов для их улучшения с целью достижения выбранных свойств, таких как целлюлаза для устойчивости к ионным жидкостям, ^{[ 11 ]} протеаза с повышенной толерантностью к моющим средствам, ^{[ 12 ]} глюкозооксидаза для аналитического применения, ^{[ 13 ]} фитаза с повышенной термостабильностью ^{[ 14 ]} и монооксигеназа с улучшенной каталитической эффективностью с использованием альтернативных доноров электронов. ^{[ 15 ]} SeSaM защищен патентом US770374 B2 более чем в 13 странах и является одной из платформенных технологий SeSaM-Biotech GmbH .

Ссылки

^ Вонг, Т.С.; Журина Д.; Шванеберг, У. (2006). «Проблема разнообразия в направленной эволюции белков». Гребень. хим. Экран высокой пропускной способности . 9 (4): 271–288. дои : 10.2174/138620706776843192 . ПМИД 16724918 .
^ Фюллен, Г.; Юван, округ Колумбия (1994). «Генетические алгоритмы и рекурсивный ансамблевый мутагенез в белковой инженерии». Комплексный Интерт . 1 .
^ Вонг, Т.С.; Роккатано, Д.; Захариас, М.; Шванеберг, У. (2006). «Статистический анализ методов случайного мутагенеза, используемых для направленной эволюции белков». Дж. Мол. Биол . 355 (4): 858–871. дои : 10.1016/j.jmb.2005.10.082 . ПМИД 16325201 .
^ Вонг, Т.С.; Ти, КЛ; Хауэр, Б.; Шванеберг, У. (2004). «Мутагенез с насыщением последовательностей (SeSaM): новый метод направленной эволюции белков» . Нуклеиновые кислоты Рез . 32 (3): е26. дои : 10.1093/нар/gnh028 . ПМЦ 373423 . ПМИД 14872057 .
^ Вонг, Т.С.; Ти, КЛ; Хауэр, Б.; Шванеберг, У. (2005). «Мутагенез с насыщением последовательностей с настраиваемой частотой мутаций». Анальный. Биохим . 341 (1): 187–189. дои : 10.1016/j.ab.2005.03.023 . ПМИД 15866543 .
^ Вонг, Т.С.; Роккатано, Д.; Лоукс, Д.; Ти, КЛ; Шенк, А.; Хауэр, Б.; Шванеберг, У. (2008). «Мутагенез с насыщением последовательностей, обогащенных трансверсией (SeSaM-Tv +): метод случайного мутагенеза с последовательными заменами нуклеотидов, который дополняет предвзятость склонной к ошибкам ПЦР». Биотехнология. Дж . 3 (1): 74–82. дои : 10.1002/biot.200700193 . ПМИД 18022859 . S2CID 9111046 .
^ д'Аббади, М.; Хофрейтер, М.; Вайсман, А.; Лоукс, Д.; Гаспарутто, Д.; Кадет, Дж.; Вудгейт, Р.; Паабо, С.; Холлигер, П. (2007). «Молекулярная селекция полимераз для амплификации древней ДНК» . Нат. Биотехнология . 25 (8): 939–943. дои : 10.1038/nbt1321 . ЧВК 1978225 . ПМИД 17632524 .
^ Мундхада, Х.; Мариенхаген, Дж.; Скасьок, А.; Шенк, А.; Роккатано, Д.; Шванеберг, У. (2011). «SeSaM-Tv-II генерирует пространство последовательностей белков, недоступное для epPCR». ХимияБиоХим 12 (10): 1595–1601. дои : 10.1002/cbic.201100010 . ПМИД 21671328 . S2CID 31951491 .
^ Рафф, Эй Джей; Мариенхаген, Дж.; Верма, Р.; Роккатано, Д.; Генизер, Х.-Г.; Ниманн, Р.; Шиванге, А.В.; Шванеберг, У. (2012). «dRTP и dPTP - комплементарная пара нуклеотидов для метода мутагенеза с насыщением последовательностей (SeSaM)». J Mol Катализатор B-фермент . 84 : 40–47. дои : 10.1016/j.molcatb.2012.04.018 .
^ Чжао, Дж.; Кардашлиев Т.; Рафф, Эй Джей; Бокола, М.; Шванеберг, М. (2014). «Уроки разнообразия экспериментов по направленной эволюции путем анализа 3000 мутаций». Биотехнология Биоинж . 111 (2): 2380–2389. дои : 10.1002/бит.25302 . ПМИД 24904008 . S2CID 27297091 .
^ Потткэмпер, Дж.; Бартен, П.; Ильмбергер, Н.; Шванеберг, Ю.; Шенк, А.; Шульте, М.; Игнатьев Н.; Стрейт, В. (2009). «Применение метагеномики для идентификации бактериальных целлюлаз, стабильных в ионных жидкостях». Зеленая химия . 11 (7): 957–965. дои : 10.1039/B820157A .
^ Ли, З.; Роккатано, Д.; Лоренц, М.; Шванеберг, У. (2012). «Направленная эволюция субтилизина Е в высокоактивную протеазу, толерантную к хлориду гуанидиния и додецилсульфату натрия». ХимБиоХим . 13 (5): 691–699. дои : 10.1002/cbic.201100714 . ПМИД 22408062 . S2CID 5134486 .
^ Гутьеррес, Э.А.; Мундхада, Х.; Мейер, Т.; Дьюфьюэл, Х.; Бокола, М.; Шванеберг, У. (2013). «Модернизированная глюкозооксидаза для амперометрического определения глюкозы в анализе диабета». Биосенс. Биоэлектрон . 50 : 84–90. дои : 10.1016/j.bios.2013.06.029 . ПМИД 23835222 .
^ Шиванге, А.В.; Роккатано, Д.; Шванеберг, У. (2016). «Итеративный опрос ключевых остатков фитазы с заменами, повышающими термостабильность, выявленными в ходе направленной эволюции» . Прил. Микробиол. Биот . 100 (1): 227–242. дои : 10.1007/s00253-015-6959-5 . ПМИД 26403922 . S2CID 10424164 .
^ Бельсаре, КД; Хорн, Т.; Рафф, Эй Джей; Мартинес, Р.; Магнуссон, А.; Холтманн, Д.; Шредер, Дж.; Шванеберг, У. (2017). «Направленная эволюция P450cin для опосредованного переноса электронов» . Инженерный дизайн и отбор белков . 30 (2): 119–127. дои : 10.1093/протеин/gzw072 . ПМИД 28007937 .

[1] Вонг, Т.С.; Журина Д.; Шванеберг, У. (2006). «Проблема разнообразия в направленной эволюции белков». Гребень. хим. Экран высокой пропускной способности . 9 (4): 271–288. дои : 10.2174/138620706776843192 . ПМИД 16724918 .

[2] Фюллен, Г.; Юван, округ Колумбия (1994). «Генетические алгоритмы и рекурсивный ансамблевый мутагенез в белковой инженерии». Комплексный Интерт . 1 .

[3] Вонг, Т.С.; Роккатано, Д.; Захариас, М.; Шванеберг, У. (2006). «Статистический анализ методов случайного мутагенеза, используемых для направленной эволюции белков». Дж. Мол. Биол . 355 (4): 858–871. дои : 10.1016/j.jmb.2005.10.082 . ПМИД 16325201 .

[4] Вонг, Т.С.; Ти, КЛ; Хауэр, Б.; Шванеберг, У. (2004). «Мутагенез с насыщением последовательностей (SeSaM): новый метод направленной эволюции белков» . Нуклеиновые кислоты Рез . 32 (3): е26. дои : 10.1093/нар/gnh028 . ПМЦ 373423 . ПМИД 14872057 .

[5] Вонг, Т.С.; Ти, КЛ; Хауэр, Б.; Шванеберг, У. (2005). «Мутагенез с насыщением последовательностей с настраиваемой частотой мутаций». Анальный. Биохим . 341 (1): 187–189. дои : 10.1016/j.ab.2005.03.023 . ПМИД 15866543 .

[6] Вонг, Т.С.; Роккатано, Д.; Лоукс, Д.; Ти, КЛ; Шенк, А.; Хауэр, Б.; Шванеберг, У. (2008). «Мутагенез с насыщением последовательностей, обогащенных трансверсией (SeSaM-Tv +): метод случайного мутагенеза с последовательными заменами нуклеотидов, который дополняет предвзятость склонной к ошибкам ПЦР». Биотехнология. Дж . 3 (1): 74–82. дои : 10.1002/biot.200700193 . ПМИД 18022859 . S2CID 9111046 .

[7] д'Аббади, М.; Хофрейтер, М.; Вайсман, А.; Лоукс, Д.; Гаспарутто, Д.; Кадет, Дж.; Вудгейт, Р.; Паабо, С.; Холлигер, П. (2007). «Молекулярная селекция полимераз для амплификации древней ДНК» . Нат. Биотехнология . 25 (8): 939–943. дои : 10.1038/nbt1321 . ЧВК 1978225 . ПМИД 17632524 .

[8] Мундхада, Х.; Мариенхаген, Дж.; Скасьок, А.; Шенк, А.; Роккатано, Д.; Шванеберг, У. (2011). «SeSaM-Tv-II генерирует пространство последовательностей белков, недоступное для epPCR». ХимияБиоХим 12 (10): 1595–1601. дои : 10.1002/cbic.201100010 . ПМИД 21671328 . S2CID 31951491 .

[9] Рафф, Эй Джей; Мариенхаген, Дж.; Верма, Р.; Роккатано, Д.; Генизер, Х.-Г.; Ниманн, Р.; Шиванге, А.В.; Шванеберг, У. (2012). «dRTP и dPTP - комплементарная пара нуклеотидов для метода мутагенеза с насыщением последовательностей (SeSaM)». J Mol Катализатор B-фермент . 84 : 40–47. дои : 10.1016/j.molcatb.2012.04.018 .

[10] Чжао, Дж.; Кардашлиев Т.; Рафф, Эй Джей; Бокола, М.; Шванеберг, М. (2014). «Уроки разнообразия экспериментов по направленной эволюции путем анализа 3000 мутаций». Биотехнология Биоинж . 111 (2): 2380–2389. дои : 10.1002/бит.25302 . ПМИД 24904008 . S2CID 27297091 .

[11] Потткэмпер, Дж.; Бартен, П.; Ильмбергер, Н.; Шванеберг, Ю.; Шенк, А.; Шульте, М.; Игнатьев Н.; Стрейт, В. (2009). «Применение метагеномики для идентификации бактериальных целлюлаз, стабильных в ионных жидкостях». Зеленая химия . 11 (7): 957–965. дои : 10.1039/B820157A .

[12] Ли, З.; Роккатано, Д.; Лоренц, М.; Шванеберг, У. (2012). «Направленная эволюция субтилизина Е в высокоактивную протеазу, толерантную к хлориду гуанидиния и додецилсульфату натрия». ХимБиоХим . 13 (5): 691–699. дои : 10.1002/cbic.201100714 . ПМИД 22408062 . S2CID 5134486 .

[13] Гутьеррес, Э.А.; Мундхада, Х.; Мейер, Т.; Дьюфьюэл, Х.; Бокола, М.; Шванеберг, У. (2013). «Модернизированная глюкозооксидаза для амперометрического определения глюкозы в анализе диабета». Биосенс. Биоэлектрон . 50 : 84–90. дои : 10.1016/j.bios.2013.06.029 . ПМИД 23835222 .

[14] Шиванге, А.В.; Роккатано, Д.; Шванеберг, У. (2016). «Итеративный опрос ключевых остатков фитазы с заменами, повышающими термостабильность, выявленными в ходе направленной эволюции» . Прил. Микробиол. Биот . 100 (1): 227–242. дои : 10.1007/s00253-015-6959-5 . ПМИД 26403922 . S2CID 10424164 .

[15] Бельсаре, КД; Хорн, Т.; Рафф, Эй Джей; Мартинес, Р.; Магнуссон, А.; Холтманн, Д.; Шредер, Дж.; Шванеберг, У. (2017). «Направленная эволюция P450cin для опосредованного переноса электронов» . Инженерный дизайн и отбор белков . 30 (2): 119–127. дои : 10.1093/протеин/gzw072 . ПМИД 28007937 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]

[ 15 ]