Молекулярная цитогенетика
Молекулярная цитогенетика объединяет две дисциплины — молекулярную биологию и цитогенетику — и включает в себя анализ структуры хромосом, позволяющий различать нормальные и раковые клетки. Цитогенетика человека началась в 1956 году, когда было обнаружено, что нормальные клетки человека содержат 46 хромосом. Однако о первых микроскопических наблюдениях хромосом сообщили Арнольд, Флемминг и Ганземан в конце 1800-х годов. Их работу игнорировали в течение десятилетий, пока фактическое число хромосом у человека не было обнаружено как 46. В 1879 году Арнольд исследовал клетки саркомы и карциномы, имеющие очень большие ядра. Сегодня изучение молекулярной цитогенетики может быть полезно в диагностике и лечении различных злокачественных новообразований, таких как гематологические злокачественные новообразования, опухоли головного мозга и других предшественников рака. В целом эта область сосредоточена на изучении эволюции хромосом, а точнее количества, структуры, функций и происхождения хромосомных аномалий. [1] [2] Он включает в себя серию методов, называемых флуоресцентной in situ гибридизацией или FISH, в которых зонды ДНК помечаются флуоресцентными метками разного цвета для визуализации одного или нескольких конкретных участков генома. Представленный в 1980-х годах метод FISH использует зонды с комплементарными последовательностями оснований для определения наличия или отсутствия определенных участков ДНК. FISH может выполняться как прямой доступ к метафазным хромосомам или интерфазным ядрам. В качестве альтернативы можно использовать косвенный подход, при котором весь геном можно оценить на предмет изменений количества копий с помощью виртуального кариотипирования. Виртуальные кариотипы генерируются из массивов, состоящих из тысяч и миллионов зондов, а вычислительные инструменты используются для воссоздания генома in silico .
Общие методы
[ редактировать ]Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)
[ редактировать ]
Флуоресцентная гибридизация in situ позволяет выявить отдельные копии или повторяющиеся последовательности ДНК посредством локализованного мечения конкретных нуклеиновых кислот. В этом методе используются различные зонды ДНК, помеченные флуоресцентными метками, которые связываются с одним или несколькими конкретными участками генома. [3] Он маркирует все отдельные хромосомы на каждой стадии клеточного деления, чтобы выявить структурные и числовые аномалии, которые могут возникнуть на протяжении всего цикла. Это делается с помощью зонда, который может быть локус-специфичным, центромерным, теломерным и полнохромосомным. Этот метод обычно выполняется на интерфазных клетках и парафиновых блоках тканей. FISH отображает единичные копии или повторяющиеся последовательности ДНК посредством маркировки локализации конкретных нуклеиновых кислот. В этом методе используются различные зонды ДНК, помеченные флуоресцентными метками, которые связываются с одним или несколькими конкретными участками генома. Сигналы флуоресцентных меток можно увидеть с помощью микроскопии , а мутации можно увидеть, сравнив эти сигналы со здоровыми клетками. Чтобы это сработало, ДНК необходимо денатурировать с помощью тепла или химических веществ, чтобы разорвать водородные связи; это позволяет происходить гибридизации после смешивания двух образцов. Флуоресцентные зонды создают новые водородные связи, восстанавливая таким образом ДНК с помощью комплементарных оснований, которые можно обнаружить с помощью микроскопии. FISH позволяет визуализировать различные части хромосомы на разных стадиях клеточного цикла. FISH может выполняться как прямой доступ к метафазным хромосомам или интерфазным ядрам. В качестве альтернативы можно использовать косвенный подход, при котором весь геном можно оценить на предмет изменений количества копий с помощью виртуального кариотипирования. Виртуальные кариотипы генерируются из микрочипов, состоящих из тысяч и миллионов зондов, а вычислительные инструменты используются для воссоздания генома in silico . [4]
Сравнительная геномная гибридизация (CGH)
[ редактировать ]Сравнительная геномная гибридизация (CGH), полученная из FISH, используется для сравнения вариаций числа копий между биологическим образцом и эталоном. Первоначально CGH был разработан для наблюдения хромосомных аберраций в опухолевых клетках. В этом методе используются два генома, образец и контроль, которые для их различения помечены флуоресцентной меткой. [5] При CGH из образца опухоли выделяют ДНК и прикрепляют биотин. Другой мечущий белок, дигоксигенин, присоединяется к эталонному образцу ДНК. [6] Меченые образцы ДНК совместно гибридизуются с зондами во время деления клеток, что является наиболее информативным временем для наблюдения за изменением числа копий. [7] CGH использует карту, показывающую относительное содержание ДНК и количество хромосом. Сравнивая флуоресценцию образца с эталоном, CGH может указать на увеличение или потерю хромосомных областей. [6] [8] CGH отличается от FISH, поскольку не требует конкретной цели или предварительного знания анализируемой генетической области. CGH также может относительно быстро сканировать весь геном на предмет различных хромосомных дисбалансов, и это полезно пациентам с генетическими проблемами, а также когда официальный диагноз неизвестен. Это часто происходит при гематологических раковых заболеваниях.
Сравнительная геномная гибридизация массивов (aCGH)
[ редактировать ]Сравнительная геномная гибридизация с использованием массивов (aCGH) позволяет проводить CGH без культуры и выделения клеток. Вместо этого его проводят на предметных стеклах, содержащих небольшие фрагменты ДНК. [9] Удаление клеточной культуры и этап изоляции значительно упрощает и ускоряет процесс. Используя принципы, аналогичные CGH, образец ДНК изолируют и флуоресцентно метят, а затем когибридизируют с одноцепочечными зондами для генерации сигналов. Тысячи этих сигналов могут быть обнаружены одновременно, и этот процесс называется параллельным скринингом. [10] Измеряются коэффициенты флуоресценции между сигналами образца и эталона, представляющие собой среднюю разницу между количеством каждого из них. Это покажет, содержится ли в образце ДНК больше или меньше, чем ожидается по эталону.
Приложения
[ редактировать ]
Гибридизация FISH-хромосомы in-situ позволяет изучать цитогенетику в пре- и постнатальных образцах, а также широко используется в цитогенетическом тестировании на рак. В то время как цитогенетика — это изучение хромосом и их структуры, цитогенетическое тестирование включает анализ клеток в крови, тканях, костном мозге или жидкости для выявления изменений в хромосомах человека. Это часто делалось с помощью кариотипирования, а теперь это делается с помощью FISH. Этот метод обычно используется для обнаружения хромосомных делеций или транслокаций, часто связанных с раком. FISH также используется при меланоцитарных поражениях, позволяющих отличить атипичную меланоцитарную или злокачественную меланому. [5]
Раковые клетки часто накапливают сложные хромосомные структурные изменения, такие как потеря, дупликация, инверсия или перемещение сегмента. [11] При использовании FISH любые изменения в хромосоме будут видны через несоответствия между раковыми хромосомами, меченными флуоресцентной меткой, и здоровыми хромосомами. [11] Результаты этих цитогенетических экспериментов могут пролить свет на генетические причины рака и определить потенциальные терапевтические цели. [12]
Молекулярная цитогенетика также может использоваться в качестве диагностического инструмента врожденных синдромов , при которых основные генетические причины заболевания неизвестны. [13] Анализ структуры хромосом пациента может выявить причинные изменения. Новые методы молекулярной биологии, разработанные за последние два десятилетия, такие как секвенирование следующего поколения и РНК-секвенирование, в значительной степени заменили молекулярную цитогенетику в диагностике, но в последнее время в медицинской практике растет использование производных FISH, таких как многоцветный FISH и многоцветный бэндинг (mBAND). приложения. [14]
Раковые проекты
[ редактировать ]Один из текущих проектов, связанных с молекулярной цитогенетикой, включает геномные исследования редких видов рака, получившие название « Инициатива по определению характеристик генома рака» (CGCI) . [15] CGCI — это группа, заинтересованная в описании генетических аномалий некоторых редких видов рака с помощью передового секвенирования геномов, экзомов и транскриптомов, которые в конечном итоге могут сыграть роль в патогенезе рака. [15] В настоящее время CGCI выявил некоторые ранее неустановленные генетические изменения при медуллобластоме и В-клеточной неходжкинской лимфоме . Следующим шагом CGCI является выявление геномных изменений в ВИЧ-положительных опухолях и лимфоме Беркитта .
Некоторые методы высокопроизводительного секвенирования, используемые CGCI, включают в себя: полногеномное секвенирование , секвенирование транскриптома , ChIP-секвенирование и Illumina Infinum MmethylationEPIC BeadCHIP . [16]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Кирни Л., Хорсли С.В. (сентябрь 2005 г.). «Молекулярная цитогенетика при гематологических злокачественных новообразованиях: современные технологии и перспективы». Хромосома . 114 (4): 286–94. дои : 10.1007/s00412-005-0002-z . ПМИД 16003502 . S2CID 19251871 .
- ^ Бигнер С.Х., Шрек Э. (ноябрь 1997 г.). «Молекулярная цитогенетика опухолей головного мозга» . Журнал невропатологии и экспериментальной неврологии . 56 (11): 1173–81. дои : 10.1097/00005072-199711000-00001 . ПМИД 9370227 .
- ^ О'Коннор С. (2008). «Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)» . Природное образование . 1 (1): 171.
- ^ Мартин Э.А., Макферран Т.А., ред. (2017). Словарь сестринского дела . Издательство Оксфордского университета.
- ^ Jump up to: а б «Цитогенетическое тестирование | DermNet NZ» . www.dermnetnz.org . Проверено 02 апреля 2020 г.
- ^ Jump up to: а б Банерджи Д. (15 января 2013 г.). Сравнительная геномная гибридизация массивов: протоколы и приложения . Нью-Йорк: Humana Press. стр. 1–13.
- ^ Пинкель Д., Альбертсон Д.Г. (2005). «Сравнительная геномная гибридизация». Ежегодный обзор геномики и генетики человека . 6 (1): 331–54. дои : 10.1146/annurev.genom.6.080604.162140 . ПМИД 16124865 .
- ^ Траск Би Джей (октябрь 2002 г.). «Цитогенетика человека: 46 хромосом, 46 лет и продолжается». Обзоры природы Генетика . 3 (10): 769–78. дои : 10.1038/nrg905 . ПМИД 12360235 . S2CID 1127220 .
- ^ Люсито Р., Хили Дж., Александр Дж., Райнер А., Эспозито Д., Чи М. и др. (октябрь 2003 г.). «Репрезентативный анализ олигонуклеотидов на микрочипах: метод высокого разрешения для обнаружения вариаций числа копий генома» . Геномные исследования . 13 (10): 2291–305. дои : 10.1101/гр.1349003 . ПМК 403708 . ПМИД 12975311 .
- ^ Робсон С.С., Читти Л.С., Моррис С., Верхуф Т., Эмблер Г., Уэлсли Д.Г., Грэм Р., Лидер С., Фишер Дж., Кролла Дж.А. (февраль 2017 г.). «Оценка сравнительной геномной гибридизации массивов в пренатальной диагностике аномалий плода: многоцентровое когортное исследование с анализом затрат и оценкой предпочтений пациентов, медицинских работников и комиссаров в отношении сравнительной геномной гибридизации массивов» . Оценка эффективности и механизма . 4 (1): 1–104. дои : 10.3310/eme04010 . ПМИД 28182369 .
- ^ Jump up to: а б Рао П.Х., Нандула С.В., Мурти В.В. (2007). «Молекулярно-цитогенетические приложения в анализе генома рака». В Фишере П.Б. (ред.). Геномика и протеомика рака: методы и протоколы . Методы молекулярной биологии. Том. 383. Хумана Пресс. стр. 165–85. дои : 10.1007/978-1-59745-335-6_11 . ISBN 9781597453356 . ПМИД 18217685 .
- ^ Ван ТС (2017). «Цитогенетика рака: Введение». В Ван ТС (ред.). Цитогенетика рака . Методы молекулярной биологии. Том. 1541. Спрингер, Нью-Йорк. стр. 1–10. дои : 10.1007/978-1-4939-6703-2_1 . ISBN 9781493967018 . ПМИД 27910009 .
- ^ Спейчер М.Р., Картер Н.П. (октябрь 2005 г.). «Новая цитогенетика: стирание границ с молекулярной биологией». Обзоры природы Генетика . 6 (10): 782–92. дои : 10.1038/nrg1692 . ПМИД 16145555 . S2CID 15023775 .
- ^ Баладжи А.С., член парламента Ханде (декабрь 2018 г.). «История и эволюция цитогенетических методов: текущие и будущие применения в фундаментальных и клинических исследованиях» . Исследования мутаций/Генетическая токсикология и экологический мутагенез . В память о профессоре Адаяпаламе Т. Натараджане. 836 (Часть А): 3–12. doi : 10.1016/j.mrgentox.2018.08.008 . ПМИД 30389159 . S2CID 53274124 .
- ^ Jump up to: а б ГеномОК (18 января 2013 г.). «Инициатива по характеристике генома рака» . Офис геномики рака . Проверено 5 октября 2019 г.
- ^ «Исследование ГеномОС» . Офис геномики рака . 04 февраля 2013 г. Проверено 5 октября 2019 г.