Цитогенетика
Цитогенетика , по сути, является разделом генетики , но также является частью клеточной биологии/цитологии (подраздела анатомии человека), которая занимается изучением того, как хромосомы связаны с поведением клеток, особенно с их поведением во время митоза и мейоза . [1] Используемые методы включают кариотипирование , анализ G- хромосом, другие методы цитогенетического связывания, а также молекулярную цитогенетику, такую как флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) и сравнительная геномная гибридизация (CGH).
История [ править ]
Начало [ править ]
Хромосомы впервые наблюдал в растительных клетках Карл Нэгели в 1842 году. Их поведение в клетках животных ( саламандры ) описал Вальтер Флемминг , первооткрыватель митоза , в 1882 году. Название придумал другой немецкий анатом, фон Вальдейер, в 1888 году.
Следующий этап наступил после развития генетики в начале 20 века, когда было признано, что набор хромосом ( кариотип ) является носителем генов. Левицкий, по-видимому, был первым, кто определил кариотип как фенотипический вид соматических хромосом в отличие от их генного содержания. [2] [3] Исследования кариотипа человека заняли много лет, чтобы решить самый основной вопрос: сколько хромосом содержит нормальная диплоидная клетка человека? [4] В 1912 году Ганс фон Винивартер сообщил о 47 хромосомах в сперматогониях и 48 в оогониях , сделав вывод о XX/XO механизме определения пола . [5] Пейнтер в 1922 году не был уверен, составляет ли диплоидное число людей 46 или 48, сначала отдавая предпочтение 46. [6] Позже он пересмотрел свое мнение с 46 на 48 и правильно настаивал на том, что у людей есть XX/XY . система определения пола [7] Учитывая их методы, эти результаты были весьма примечательными. В научных книгах число хромосом человека оставалось равным 48 на протяжении более тридцати лет. Чтобы исправить эту ошибку, потребовались новые методы. Джо Хин Тджио работает в Альберта Левана лаборатории [8] [9] отвечал за поиск подхода:
- Использование клеток в культуре
- Предварительная обработка клеток гипотоническим раствором , который набухает и распределяет хромосомы.
- Задержка митоза в метафазе раствором колхицина
- Сдавливание препарата на предметном стекле, выравнивание хромосом в одной плоскости
- Разрезание микрофотографии и преобразование результата в бесспорную кариограмму.
Только в 1956 году стало общепризнанным, что кариотип человека включает только 46 хромосом. [10] [11] [12] У человекообразных обезьян 48 хромосом. Человеческая хромосома 2 образовалась в результате слияния предковых хромосом, уменьшив их количество. [13]
цитогенетики Приложения
МакКлинтока кукурузе Работа по
Барбара МакКлинток начала свою карьеру в качестве цитогенетика кукурузы . В 1931 году МакКлинток и Гарриет Крейтон продемонстрировали, что цитологическая рекомбинация меченых хромосом коррелирует с рекомбинацией генетических признаков ( генов ). МакКлинток, работая в Институте Карнеги , продолжил предыдущие исследования механизмов разрыва хромосом и вспышки слияния у кукурузы. Она идентифицировала конкретное событие разрыва хромосомы, которое всегда происходило в одном и том же локусе девятой хромосомы кукурузы, которое она назвала локусом « Ds» или «диссоциацией». [14] МакКлинток продолжила свою карьеру в области цитогенетики, изучая механику и наследование сломанных и кольцевых (кольцевых) хромосом кукурузы. В ходе своей цитогенетической работы МакКлинток открыла транспозоны , и эта находка в конечном итоге привела к ее Нобелевской премии в 1983 году.
дрозофилы Естественные популяции
В 1930-х годах Добжанский и его коллеги собрали Drosophila pseudoobscura и D. persimilis в диких популяциях Калифорнии и соседних штатов. Используя технику художника. [15] они изучили политенные хромосомы и обнаружили, что дикие популяции полиморфны по хромосомным инверсиям . Все мухи выглядят одинаково, какие бы инверсии они ни имели: это пример загадочного полиморфизма. [ нужна ссылка ]
Быстро накопились доказательства того, что за это естественный отбор ответственен . Используя метод, изобретенный Л'Эритье и Тейсье, Добжанский разводил популяции в клетках для популяций , что позволяло их кормить, размножать и брать образцы, предотвращая при этом побег. Это позволило исключить миграцию как возможное объяснение результатов. Запасы, содержащие инверсии с известной начальной частотой, можно поддерживать в контролируемых условиях. Было обнаружено, что различные типы хромосом не колеблются случайным образом, как если бы они были выборочно нейтральными, а приспосабливаются к определенным частотам, на которых они стабилизируются. К моменту выхода в свет третьего издания своей книги Добжанского в 1951 г. [16] он был убежден, что хромосомные морфы сохраняются в популяции благодаря селективному преимуществу гетерозигот, как и в случае с большинством полиморфизмов . [17] [18]
Лилия и мышь [ править ]
Лилия является предпочтительным организмом для цитологического исследования мейоза, поскольку хромосомы большие и каждую морфологическую стадию мейоза можно легко идентифицировать микроскопически. Хотта, Чендли и др. [19] представили доказательства общего паттерна синтеза разрывов и репарации ДНК в мужских мейотических клетках лилий и грызунов на зиготенно-пахитенных стадиях мейоза, когда предполагалось возникновение кроссинговера. Наличие общего паттерна между такими филогенетически далекими организмами, как лилия и мышь, привело авторов к выводу, что организация мейотического кроссинговера, по крайней мере, у высших эукариот, вероятно, универсальна по распространению. [ нужна ссылка ]
и применение Человеческие аномалии медицинское
После появления процедур, которые позволили легко подсчитать хромосомы, быстро были сделаны открытия, связанные с аберрантными хромосомами или числом хромосом. [ нужна ссылка ]
Конституционная цитогенетика. При некоторых врожденных нарушениях, таких как синдром Дауна , цитогенетика выявила природу хромосомного дефекта: «простую» трисомию. Аномалии, возникающие в результате событий нерасхождения , могут вызывать анеуплоидию клеток (добавление или удаление целых хромосом) у одного из родителей или у плода. В 1959 году Лежен [20] обнаружили, что у пациентов с синдромом Дауна была дополнительная копия хромосомы 21. Синдром Дауна также называют трисомией 21.
Другие обнаруженные числовые аномалии включают аномалии половых хромосом. У женщины только с одной Х-хромосомой наблюдается синдром Тернера , тогда как у мужчины с дополнительной Х-хромосомой, в результате чего общее количество хромосом составляет 47, развивается синдром Клайнфельтера . Многие другие комбинации половых хромосом совместимы с живорождением, включая XXX , XYY и XXXX. Способность млекопитающих переносить анеуплоидии половых хромосом обусловлена способностью их инактивировать , что необходимо нормальным самкам для компенсации наличия двух копий хромосомы. Не все гены Х-хромосомы инактивированы, поэтому у людей с дополнительными Х-хромосомами наблюдается фенотипический эффект. [ нужна ссылка ]
Трисомия 13 была связана с синдромом Патау , а трисомия 18 — с синдромом Эдвардса . [ нужна ссылка ]
Приобретенная цитогенетика: в 1960 году Питер Ноуэлл и Дэвид Хангерфорд. [21] обнаружили небольшую хромосому в лейкоцитах больных хроническим миелогенным лейкозом (ХМЛ). Эту аномальную хромосому назвали Филадельфийской хромосомой — поскольку оба учёных проводили свои исследования в Филадельфии, штат Пенсильвания . Тринадцать лет спустя, с развитием более совершенных методов, Джанет Роули показала, что аномальная хромосома является результатом транслокации хромосом 9 и 22. Идентификация Филадельфийской хромосомы с помощью цитогенетики является диагностическим признаком ХМЛ. В настоящее время более 780 лейкозов и сотни солидных опухолей (легких, предстательной железы, почек и др.) характеризуются приобретенными хромосомными аномалиями, прогностическое значение которых имеет решающее значение. Выявление этих хромосомных аномалий привело к открытию очень большого количества «раковых генов» (или онкогенов ). Растущее знание этих раковых генов теперь позволяет разрабатывать таргетные методы лечения , которые меняют перспективы выживания пациентов. Таким образом, цитогенетика играла и продолжает играть важную роль в прогрессе понимания рака. Большие базы данных ( Атлас генетики и цитогенетики в онкологии и гематологии , база данных рака COSMIC , база данных Мительмана по хромосомным аберрациям и слияниям генов при раке ) позволяют исследователям и клиницистам иметь необходимый корпус для работы в этой области.
Появление бандажирования техник
В конце 1960-х годов Торбьёрн Касперссон разработал метод хинакринного флуоресцентного окрашивания (Q-бэндинг), который выявил уникальные образцы полос для каждой пары хромосом. Это позволило дифференцировать пары хромосом одинакового размера по четким рисункам горизонтальных полос. Паттерны полос теперь используются для выяснения точек разрыва и составляющих хромосом, участвующих в хромосомных транслокациях . Делеции и инверсии внутри отдельной хромосомы также можно идентифицировать и описать более точно, используя стандартизированную номенклатуру полос. G-полосатость (с использованием трипсина и окраски по Гимзе/Райту) была одновременно разработана в начале 1970-х годов и позволяет визуализировать структуру полос с помощью светлопольного микроскопа. [ нужна ссылка ]
Диаграммы, идентифицирующие хромосомы на основе шаблонов полос, известны как идиограммы . Эти карты стали основой как для пренатальных, так и для онкологических исследований, что позволило быстро перенести цитогенетику в клиническую лабораторию, где кариотипирование позволило ученым искать хромосомные изменения. Методы были расширены, чтобы обеспечить возможность культивирования свободных амниоцитов, извлеченных из амниотической жидкости , а также методы элонгации для всех типов культур, которые позволяют выполнять бандаж с более высоким разрешением. [ нужна ссылка ]
молекулярной цитогенетики Начало
В 1980-е годы были достигнуты успехи в молекулярной цитогенетике . Хотя с 1969 года зонды, меченные радиоизотопами, гибридизировались с ДНК , теперь произошел сдвиг в использовании зондов, меченных флуоресцентной меткой. Гибридизация их с хромосомными препаратами с использованием существующих методов стала известна как флуоресцентная in situ гибридизация (FISH). [22] Это изменение значительно расширило использование методов зондирования, поскольку зонды с флуоресцентной меткой более безопасны. Дальнейшие достижения в области микроманипуляций и исследования хромосом привели к появлению техники микродиссекции хромосом , с помощью которой можно было изолировать, клонировать и изучать все более подробно отклонения в структуре хромосом. [ нужна ссылка ]
Техники [ править ]
Кариотипирование [ править ]
Рутинный хромосомный анализ ( кариотипирование ) относится к анализу метафазных хромосом, которые были объединены с помощью трипсина, а затем по Гимзе , Лейшманну или их смеси. Это создает уникальные узоры полос на хромосомах. Молекулярный механизм и причина этих закономерностей неизвестны, хотя, вероятно, они связаны со временем репликации и упаковкой хроматина. [ нужна ссылка ]
В цитогенетических лабораториях используется несколько методов объединения хромосом. Окрашивание хинакрином (Q-окрашивание) было первым методом окрашивания, использовавшимся для получения определенного рисунка полос. Для этого метода требуется флуоресцентный микроскоп, и он уже не так широко используется, как определение полос Гимзы (G-бэндинг). Обратные полосы, или R-полосы, требуют термической обработки и меняют обычный черно-белый рисунок, который наблюдается в G-диапазонах и Q-диапазонах. Этот метод особенно полезен для окрашивания дистальных концов хромосом. Другие методы окрашивания включают окрашивание C-бэндов и окрашивание ядрышковой организующей области (окрашивание NOR). Эти последние методы специфически окрашивают определенные участки хромосомы. С-бэндинг окрашивает конститутивный гетерохроматин , который обычно лежит вблизи центромеры, а окрашивание NOR выделяет сателлиты и стебли акроцентрических хромосом . [ нужна ссылка ]
Бэндинг высокого разрешения включает окрашивание хромосом во время профазы или ранней метафазы (прометафазы), прежде чем они достигнут максимальной конденсации. Поскольку профазные и прометафазные хромосомы более протяженны, чем метафазные хромосомы, количество полос, наблюдаемых для всех хромосом ( полос на гаплоидный набор , bph; «уровень полос»), увеличивается примерно с 300–450 до целых 800. Это позволяет обнаруживать менее очевидные отклонения, обычно не наблюдаемые при обычном бандажировании. [23]
Подготовка слайдов [ править ]
Клетки костного мозга , крови, околоплодных вод, пуповинной крови , опухолей и тканей (включая кожу, пуповину , ворсинки хориона, печень и многие другие органы) можно культивировать с использованием стандартных методов культивирования клеток, чтобы увеличить их количество. ингибитор митоза ( колхицин , колцемид Затем к культуре добавляют ). Это останавливает деление клеток при митозе , что позволяет увеличить выход митотических клеток для анализа. Затем клетки центрифугируют, среду и митотический ингибитор удаляют и заменяют гипотоническим раствором. Это приводит к набуханию лейкоцитов или фибробластов, что приводит к распространению хромосом при добавлении на предметное стекло, а также к лизису эритроцитов. После того как клеткам дают возможность постоять в гипотоническом растворе, фиксатор Карнуа (3:1 метанол : ледяная уксусная кислота добавляют ). Это убивает клетки и затвердевает ядра оставшихся лейкоцитов. Клетки обычно фиксируют несколько раз, чтобы удалить остатки или оставшиеся эритроциты. Затем клеточную суспензию наносят на предметные стекла. После выдержки слайдов в печи или ожидания в течение нескольких дней они готовы к бандажированию и анализу.
Анализ [ править ]
Анализ полосчатых хромосом проводится под микроскопом специалистом клинической лаборатории по цитогенетике (CLSp(CG)). Обычно анализируют 20 клеток, чего достаточно, чтобы исключить мозаицизм до приемлемого уровня. Результаты суммируются и передаются сертифицированному цитогенетику для проверки и написания интерпретации с учетом предыдущего анамнеза пациента и других клинических данных. Результаты затем публикуются в Международной системе цитогенетической номенклатуры человека 2009 (ISCN2009).
in situ гибридизация Флуоресцентная
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) означает использование флуоресцентно-меченного зонда для гибридизации с препаратами цитогенетических клеток.
Помимо стандартных препаратов FISH также можно проводить:
- мазки костного мозга
- мазки крови
- препараты тканей, залитые парафином
- ферментативно диссоциированные образцы тканей
- некультивированный костный мозг
- некультивированные амниоциты
- Цитоспин Препараты
Подготовка слайдов [ править ]
В данном разделе речь идет о приготовлении стандартных цитогенетических препаратов.
Слайд состаривают с использованием солевого раствора, обычно состоящего из 2X SSC (соль, цитрат натрия). Затем предметные стекла обезвоживают в этаноле и добавляют смесь зондов. Затем образец ДНК и ДНК-зонд совместно денатурируют с использованием нагретой пластины и оставляют повторно отжигаться в течение по меньшей мере 4 часов. Затем предметные стекла промывают для удаления избытка несвязавшегося зонда и докрашивают 4',6-диамидино-2-фенилиндолом ( DAPI ) или йодидом пропидия.
Анализ [ править ]
Анализ образцов FISH проводится методом флуоресцентной микроскопии специалистом клинической лаборатории по цитогенетике. В онкологии, как правило, оценивают большое количество интерфазных клеток, чтобы исключить остаточную болезнь низкого уровня. Обычно подсчитывают и оценивают от 200 до 1000 клеток. При врожденных проблемах обычно оценивают 20 метафазных клеток. [ нужна ссылка ]
Будущее цитогенетики
В настоящее время достижения сосредоточены на молекулярной цитогенетике , включая автоматизированные системы для подсчета результатов стандартных препаратов FISH и методы виртуального кариотипирования , такие как сравнительные массивы геномной гибридизации, массивы CGH и однонуклеотидного полиморфизма .
См. также [ править ]
Ссылки [ править ]
- ^ Ригер, Р.; Михаэлис, А.; Грин, М.М. (1968), Глоссарий генетики и цитогенетики: классическая и молекулярная , Нью-Йорк: Springer-Verlag, ISBN. 978-0-387-07668-3
- ^ Levitsky, Grigorii Andreevich (1924). Material'nye osnovy nasledstvennosti [ The Material Basis of Heredity ] (in Russian). Kiev: Gosizdat Ukrainy. [ нужна страница ]
- ^ Левицкий Г.А. (1931). «Морфология хромосом». Бык. Прикладной бот. Жене. Порода растений . 27 : 19–174.
- ^ Коттлер, Малкольм Джей (1974). «От 48 до 46: цитологический метод, предвзятое мнение и подсчет хромосом человека». Бюллетень истории медицины . 48 (4): 465–502. JSTOR 44450164 . ПМИД 4618149 . ПроКвест 1296285397 .
- ^ фон Винивартер Х (1912). «Изучение сперматогенеза человека». Арх. Биология (на французском языке). 27 (93): 147–149.
- ^ Художник Т.С. "Сперматогенез человека" с. 129 дюймов «Рефераты» . Анатомическая запись . 23 (1): 89–132. Январь 1922 г. doi : 10.1002/ar.1090230111 .
- ^ Художник Теофил С. (апрель 1923 г.). «Исследования сперматогенеза млекопитающих. II. Сперматогенез человека». Журнал экспериментальной зоологии . 37 (3): 291–336. дои : 10.1002/jez.1400370303 .
- ^ Райт, Пирс (11 декабря 2001 г.). «Джо Хин Тджио. Человек, который взломал подсчет хромосом» . Хранитель . Архивировано из оригинала 25 августа 2017 года.
- ^ Саксон, Вольфганг (7 декабря 2001 г.). «Джо Хин Тджио, 82 года; биолог-исследователь подсчитал хромосомы» . Нью-Йорк Таймс . Архивировано из оригинала 12 мая 2013 года.
- ^ Тио, Джо Хин; Леван, Альберт (9 июля 2010 г.). «Число хромосом человека» . Эредитас . 42 (1–2): 723–4. дои : 10.1111/j.1601-5223.1956.tb03010.x . ПМИД 345813 .
- ^ Сюй, ТК (2012). Цитогенетика человека и млекопитающих: историческая перспектива . Springer Science & Business Media. ISBN 978-1-4612-6159-9 . [ нужна страница ]
- ^ «Генетика человека (биология) :: Хромосомы человека — Интернет-энциклопедия Britannica» . Архивировано из оригинала 17 февраля 2011 г. Проверено 15 марта 2011 г. Британская энциклопедия, Хромосома человека
- ^ «Слияние хромосом» . Архивировано из оригинала 9 августа 2011 г. Проверено 29 мая 2010 г. Страницы эволюции, Слияние хромосом
- ^ Равиндран, Сандип (11 декабря 2012 г.). «Барбара МакКлинток и открытие прыгающих генов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 109 (50): 20198–20199. дои : 10.1073/pnas.1219372109 . ПМЦ 3528533 . ПМИД 23236127 .
- ^ Художник, Т.С. (22 декабря 1933 г.). «Новый метод изучения хромосомных перестроек и построения хромосомных карт». Наука . 78 (2034): 585–586. Бибкод : 1933Sci....78..585P . дои : 10.1126/science.78.2034.585 . ПМИД 17801695 .
- ^ Добжанский Т. 1951. Генетика и происхождение видов . 3-е изд., Издательство Колумбийского университета, Нью-Йорк.
- ^ Добжанский Т. 1970. Генетика эволюционного процесса . Издательство Колумбийского университета, Нью-Йорк
- ^ [Добжанский Т.] 1981. Генетика природных популяций Добжанского . редакторы Левонтин Р.К., Мур Дж.А., Провайн В.Б. и Уоллес Б. Издательство Колумбийского университета, Нью-Йорк
- ^ Хотта, Ясуо; Чендли, Энн С.; Стерн, Герберт (сентябрь 1977 г.). «Мейотический кроссинговер у лилии и мыши». Природа . 269 (5625): 240–242. Бибкод : 1977Natur.269..240H . дои : 10.1038/269240a0 . ПМИД 593319 . S2CID 4268089 .
- ^ Лежен, Жером; Готье, Марта; Терпин, Раймонд (16 марта 1959 г.). «Исследование соматических хромосом 9 монголоидных детей». Еженедельные отчеты сессий Академии наук (на французском языке). 248 (11): 1721–1722. OCLC 871332352 . ПМИД 13639368 . НАИД 10008406728 .
- ^ Nowell PC, Хангерфорд, Д.А.. «Минутная хромосома при хроническом гранулоцитарном лейкозе человека». стр. 1497–1501 в «Национальная академия наук». Наука . 132 (3438): 1488–1501. 18 ноября 1960 г. doi : 10.1126/science.132.3438.1488 . ПМИД 17739576 .
- ^ Гупта, ПК (2007). Цитогенетика . Публикации Растоги. ISBN 978-81-7133-737-8 . [ нужна страница ]
- ^ Гейерсбах, Кэтрин Б.; Гардинер, Анна Э.; Уилсон, Эндрю; Шетти, Шаширеха; Брюйер, Элен; Забавски, Джеймс; Сакс, Дебра Ф.; Гаулин, Ребекка; Уильямсон, Синтия; Ван Дайк, Дэниел Л. (февраль 2014 г.). «Субъективность в оценке уровня хромосомных полос: многоцентровое исследование» . Генетика в медицине . 16 (2): 170–175. дои : 10.1038/gim.2013.95 . ПМИД 23887773 .
Внешние ссылки [ править ]
- Цитогенетический справочник
- Ресурсы по цитогенетике, заархивированные 26 мая 2017 г. в Wayback Machine.
- Цитогенетика человека - хромосомы и кариотипы
- Ассоциация генетических технологов
- Ассоциация клинических цитогенетиков
- Медицинский блог Гладвина. Архивировано 8 ноября 2006 г. в Wayback Machine.
- Цитогенетика - Технологии, рынки и компании
- Цитогенетические методы и устранение неисправностей
- Отдел цитогенетики Викиверситета
