Рибозим топорика
| Топор | |
|---|---|
 Консенсусная вторичная структура и консервативность последовательности рибозима Hatchet | |
| Идентификаторы | |
| Символ | Топор |
| Рфам | RF02678 |
| Другие данные | |
| РНК Тип | Джин ; Рибозим |
| ИДТИ | ИДТИ: 0003824 |
| ТАК | ТАК: 0000374 |
| PDB Структуры | ПДБе |
Справочная информация: представляет Рибозим топорика собой структуру РНК, которая катализирует собственное расщепление в определенном сайте. Другими словами, это саморасщепляющийся рибозим . Рибозимы Hatchet были открыты с помощью стратегии биоинформатики [ 1 ] как РНК, связанные с генами, связанными с рибозимами Twister и Hammerhead, или RAGATH .
Последующий биохимический анализ подтверждает вывод о функции рибозима и определяет дальнейшие характеристики химической реакции, катализируемой рибозимом. [ 2 ]
Нуклеолитические рибозимы представляют собой небольшие РНК, которые образуют компактные складки, способные к реакциям сайт-специфического расщепления/связывания. На сегодняшний день идентифицировано 14 уникальных нуклеолитических рибозимов, включая недавно открытые рибозимы «твистер» , «пистолет» , «твистер-сестра» и «топорик», которые были идентифицированы на основе применения алгоритмов сравнительной последовательности и структурирования.
Консенсусная последовательность и вторичная структура этого класса включают 13 высококонсервативных и множество других умеренно консервативных нуклеотидов, рассеянных среди выпуклостей, связывающих четыре подструктуры спаренных оснований. Репрезентативный рибозим топорика требует двухвалентных катионов, таких как Mg. 2+ способствовать расщеплению цепи РНК с максимальной константой скорости ~ 4 / мин. Как и все другие малые саморасщепляющиеся рибозимы, открытые к настоящему времени, рибозимы топорика используют общий механизм катализа, состоящий из нуклеофильной атаки рибозо-2' - атома кислорода на соседний фосфорный центр. Кинетические характеристики реакции демонстрируют, что представители этого класса рибозимов имеют существенную потребность в катионах двухвалентных металлов и что они имеют сложный активный центр, который использует несколько каталитических стратегий для ускорения расщепления РНК за счет внутреннего переноса фосфоэфира. [ 3 ]
Механизм
[ редактировать ]Нуклеолитические рибозимы, такие как рибозим Hatchet, используют SN2-подобный механизм, который приводит к сайт-специфическому расщеплению фосфодиэфирной связи. Активированный 2' - рибозы ОН 5'- по отношению к расщепленному фосфату принимает линейное выравнивание для нацеливания на соседнюю, подлежащую расщеплению фосфодиэфирную связь P-O5 ' , что приводит к образованию 2 ' ,3' - циклического фосфата и 5' - ОН-группы. Рентгенокристаллографические структурные исследования рибозимов «головка молотка» , «шпилька» , GlmS , вирус гепатита дельта (HDV), сателлит Варкуд и пистолетный рибозим определили общую складку РНК, расположение каталитических карманов, линейное выравнивание и ключевые остатки, которые способствуют реакции расщепления. Сайт расщепления расположен на 5'-конце консенсусного вторичного мотива. [ 4 ]
Кроме того, удаление нуклеофильного гидроксила делает рибозим неактивным, поскольку он не способен создавать сайт расщепления. Более конкретно, если 2'-рибоза или 2'-ОН заменены на 2'-дезоксирибозу или 2'-H, не останется доступных электронов для осуществления нуклеофильной атаки на соседнюю фосфатную группу. В результате фосфоэфирная связь не образуется, что снова инактивирует способность рибозима к ферментативному расщеплению.
Вторичная структура
[ редактировать ]В 2019 году исследователи кристаллизовали продукт рибозима Hatchet размером 2,1 Å. Последовательность консенсуса изображена на изображении справа. Большинство рибозимов топорика и рибозимов в целом принимают конфигурацию P0. P0 представляет собой дополнительную шпильку, расположенную на 5'-конце сайта расщепления, хотя она не способствует каталитической активности или функциональности в отличие от рибозимов Hammerhead , которые имеют короткую консенсусную последовательность вблизи P1 или 5'-конца, что способствует высокоскоростному каталитическому процессу. активность. Около 90% последовательности консервативны и аналогичны другим рибозимам этого класса. [ 1 ]
Судя по последовательности РНК, результирующая последовательность ДНК, которая в конечном итоге кодирует рибозим Хэтчета, имеет следующий вид: 5'-3', поскольку в ДНК урацил заменен тимином.
TTAGCAAGAATGACTATAGTCACTG TTTGTACACCCCGAATAGATTAGAA GCTAATCATAATCACGTCTGCAAT TTTGGTACA
Благодаря этой конструкции последовательности после самокаталитического расщепления она оставляет 8-нуклеотидный остаток выше на 3'-конце РНК. [ 5 ]
Третичная структура
[ редактировать ]Каждый рибозим может иметь разные мотивы и, следовательно, разные третичные структуры:
Третичная структура рибозима Hatchet с мотивом HT-UUCG образуется в результате димеризации. Димер образуется путем замены 3'-концов спаривающихся цепей, что также находится в равновесии с образовавшимся димером продуктом HT-GAAA. Следовательно, последовательность РНК меняется между конфигурациями мономера и димера. Чтобы просмотреть трехмерную форму рибозима, см. Рисунок S1A и B. [ 4 ] Две молекулы рибозима HT-GAAA фактически могут образовывать псевдосимметричный димер, причем оба мономера рибозима демонстрируют относительно четко определенную электронную плотность. Третичная складка состоит из четырех структур стебля, которые ковалентно накладываются друг на друга, образуя спиральные и петлевые структуры, называемые P1, P2, P3 и P4, L1, L2 и L3 соответственно (хотя это не показано на рисунке выше). Фактическое место расщепления расположено между соединением P1 и P2, рядом с P3 и L2. P1 состоит из трех или шести пар оснований примерно в 40% и 60% случаев соответственно в своем естественном состоянии, что позволяет предположить, что длина соответствует каталитической функции. [ 3 ]
Существует также консервативная палиндромная последовательность между основаниями U70' и A67', которая, вероятно, запускает образование димера из-за взаимодействий пар оснований Уотсона-Крика .
Третичная структура также имеет внутри себя долгосрочные последствия, основанные на взаимодействиях между ее петлями. [ 4 ]
Влияние pH и Mg 2+
[ редактировать ]Эксперименты по рибозимному катализу проводили путем добавления MgCl 2 и останавливали измерения в каждый момент времени путем добавления стоп-раствора, содержащего мочевину и ЭДТА.
График значений k obs, измеренных при pH 7,5 с увеличением концентрации Mg 2+ . Наблюдается резкое увеличение функции рибозимов, которая выходит на плато при приближении концентрации к 10 мМ. Крутой наклон, наблюдаемый при более низких значениях Mg 2+ концентрации позволяют предположить, что для достижения максимальной активности рибозима каждой РНК необходимо более одного иона металла. Более того, это говорит о том, что конструкция требует более высоких, чем обычно, физиологических концентраций Mg. 2+ полностью насытиться Mg 2+ в качестве кофактора. Возможно, что нативные мономолекулярные конструкции, также несущие P0, могут достигать насыщения при концентрациях Mg. 2+ которые ближе к нормальному физиологическому уровню.
Влияние рН на константу скорости рибозимов в реакциях, содержащих 10 мМ Mg 2+ также было измерено экспериментально. Зависимая от pH активность рибозима возрастает линейно с наклоном 1 до достижения kobs графика Михаэлиса-Ментена , плато ~4/мин вблизи значения pH 7,5. Любое более высокое значение pH имеет тот же каталитический эффект, а более кислое значение pH начинает денатурировать рибозим и, таким образом, снижать каталитическую функцию. Как зависимость от pH, так и максимальная константа скорости имеют интересные последствия для возможных каталитических стратегий, используемых этим классом рибозимов. [ 3 ]
Влияние ионов различных одно- и двухвалентных металлов на активность рибозима топорика
[ редактировать ]Рибозимная конструкция Hatchet остается полностью неактивной при инкубации в отсутствие Mg. 2+ в реакциях, содержащих только другие одновалентные катионы при 1 М (Na + , К + , руб. + , Что + , Кс + ), 2,5 М (Na + , К + ), или 3 М (Li + ). Напротив, ионы других двухвалентных металлов, таких как Mn 2+ , Ко 2+ , Зн 2+ и компакт-диск 2+ поддерживают функцию рибозимов с разной степенью эффективности. Кроме того, два иона металла (Zn 2+ , компакт-диск 2+ ) функционируют только при низких концентрациях, а три иона металла (Ba 2+ , Является 2+ и Cu 2+ ) ингибируют активность при 0,5 мМ, даже когда Mg 2+ присутствует. Эти результаты показывают, что рибозимы топорика относительно ограничены в использовании катионов для стимулирования катализа, что, возможно, указывает на то, что в структуре РНК или, возможно, даже в активном сайте присутствуют один или несколько специализированных сайтов связывания, которые вмещают ограниченное количество двухвалентных катионов. Ингибирование некоторыми ионами двухвалентных металлов может быть обусловлено смещением критического Mg 2+ ионов или общего нарушения сворачивания РНК. [ 3 ]
Значение/Применение
[ редактировать ]Одним из стандартных применений является использование фланкирующих саморасщепляющихся рибозимов для создания точно вырезанных последовательностей функциональных молекул РНК (т.е. shRNA , saiRNA , sgRNA ). Это особенно полезно для экспрессии in vivo систем редактирования генов (т.е. CRISPR / Cas sgRNA ) и ингибирующих систем. [ 6 ]
Другой метод предназначен для транскрипции миРНК in vivo . В этой конструкции используются несколько саморасщепляющихся рибозимов, которые транскрибируются из одного и того же гена. После расщепления обе части миРНК-предшественника (миРНК 1 и 2) могут образовывать двойную цепь и действовать по назначению. Чтобы увидеть настройку, см. рисунок saiRNA. [ 7 ]
Наконец, если вы хотите объединить саморасщепляющиеся рибозимы с белковыми последовательностями, важно знать, что механизм саморасщепления рибозимов будет модифицировать мРНК. 5'-рибозим модифицирует нижний 5'-конец пре-мРНК, не позволяя клетке создавать 5'-кэп. Это снижает стабильность пре-мРНК и не позволяет ей стать полностью функциональной зрелой мРНК. С другой стороны, 3'-рибозим будет предотвращать полиаденилирование вышележащей пре-мРНК, снова снижая стабильность и предотвращая созревание. Оба также мешают переводу. [ 5 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Вайнберг З., Ким П.Б., Чен Т.Х., Ли С., Харрис К.А., Люнсе CE, Брейкер Р.Р. (2015). «Новые классы саморасщепляющихся рибозимов, выявленные методом сравнительного геномного анализа» . Нат. хим. Биол . 11 (8): 606–10. дои : 10.1038/nchembio.1846 . ПМК 4509812 . ПМИД 26167874 .
- ^ Ли С., Люнсе CE, Харрис К.А., Брейкер Р.Р. (2015). «Биохимический анализ топорных саморасщепляющихся рибозимов» . РНК . 21 (11): 1845–51. дои : 10.1261/rna.052522.115 . ПМЦ 4604424 . ПМИД 26385510 .
- ^ Jump up to: а б с д Ли, Саньшу; Люнсе, Кристина Э.; Харрис, Кимберли А.; Брейкер, Рональд Р. (ноябрь 2015 г.). «Биохимический анализ топорных саморасщепляющихся рибозимов» . РНК . 21 (11): 1845–1851. дои : 10.1261/rna.052522.115 . ISSN 1355-8382 . ПМЦ 4604424 . ПМИД 26385510 .
- ^ Jump up to: а б с Чжэн, Лукиан; Фальшлюнгер, Кристоф; Хуан, Кайи; Майрхофер, Элизабет; Юань, Шугуан; Ван, Цзюньчэн; Патель, Диншоу Дж.; Микура, Рональд; Рен, Прицеливание (14 мая 2019 г.). «Структура рибозима Топорика и значение механизма расщепления» . Труды Национальной академии наук . 116 (22): 10783–10791. Бибкод : 2019PNAS..11610783Z . дои : 10.1073/pnas.1902413116 . ISSN 0027-8424 . ПМК 6561176 . ПМИД 31088965 .
- ^ Jump up to: а б «Команда: Гамбург/Вклад – 2020.igem.org» . 2020.igem.org . Проверено 24 ноября 2021 г.
- ^ Гао, Янбинь; Чжао, Юнде (апрель 2014 г.). «Самопроцессинг РНК с рибозимами в направляющие РНК in vitro и in vivo для редактирования генома с помощью CRISPR» . Журнал интегративной биологии растений . 56 (4): 343–349. дои : 10.1111/jipb.12152 . ISSN 1672-9072 . ПМИД 24373158 .
- ^ "Содержание" . labs.biology.ucsd.edu . Проверено 24 ноября 2021 г.