Элемент раскручивания ДНК

Элемент раскручивания ДНК ( DUE или DNAUE ) является местом инициации открытия структуры двойной спирали ДНК в начале репликации для синтеза ДНК . ^{[ 1 ]} Он богат АТ и легко денатурирует из-за своей низкой спиральной стабильности. ^{[ 2 ]} что позволяет распознавать одноцепочечную область комплексом распознавания происхождения .

DUE обнаружены как в прокариотических , так и в эукариотических организмах, но впервые были обнаружены у дрожжей и бактерий Хуангом Ковальским. ^{[ 3 ]}^{[ 4 ]} Раскручивание ДНК открывает доступ механизму репликации к новым одиночным нитям. ^{[ 1 ]} У эукариот DUE являются местом связывания белков, связывающих элементы раскручивания ДНК (DUE-B), необходимых для инициации репликации. ^{[ 3 ]} У прокариот DUE обнаружены в виде тандемных консенсусных последовательностей, фланкирующих 5'-конец домена связывания ДНК. ^{[ 2 ]} Акт раскручивания этих богатых АТ элементов происходит даже в отсутствие каких-либо связывающих белков из-за отрицательных сил суперспирализации , что делает его энергетически выгодным действием. ^{[ 2 ]} DUE обычно обнаруживаются в пределах 30–100 п.н. от начала репликации. ^{[ 4 ]}^{[ 5 ]}

Функция

Специфическое раскручивание DUE позволяет инициировать сборку комплекса в месте репликации одноцепочечной ДНК, как обнаружил Хуан Ковальски. ^{[ 4 ]} ДНК -хеликаза и связанные с ней ферменты теперь могут связываться с развернутой областью, создавая начало репликационной вилки . Раскручивание этой области дуплексной нити связано с низкой потребностью в свободной энергии из-за спиральной нестабильности, вызванной специфическими взаимодействиями укладки оснований в сочетании с противодействием сверхспирализации. ^{[ 4 ]}^{[ 6 ]} Отрицательная сверхспирализация позволяет ДНК оставаться стабильной при плавлении, что обусловлено уменьшением скручивающего напряжения. ^{[ 5 ]} Обнаружен в источниках репликации как бактерий, так и дрожжей, а также присутствует у некоторых млекопитающих. ^{[ 5 ]} Установлено, что длина составляет от 30 до 100 пар оснований. ^{[ 4 ]}^{[ 5 ]}

Прокариоты

У прокариот большую часть времени репликация ДНК происходит из одного источника репликации на одной цепи последовательности ДНК. Независимо от того, является ли этот геном линейным или кольцевым, у бактерий есть собственный механизм, необходимый для репликации. ^{[ 7 ]}

Процесс

белок DnaA . У бактерий инициатором репликации является ^{[ 8 ]} Он загружается в oriC в последовательность бокса DnaA, где он связывает и собирает нити, чтобы открыть дуплекс и рекрутировать хеликазу DnaB с помощью DnaC . ДНКА высококонсервативна и имеет два ДНК-связывающих домена. Прямо перед этим блоком ДНКА находятся три тандемные 13-мерные последовательности. Эти тандемные последовательности, обозначенные L, M, R от 5' до 3', представляют собой бактериальные DUE. Две из трех этих богатых АТ областей (M и R) раскручиваются при связывании DnaA с блоком DnaA из-за непосредственной близости к раскручивающемуся дуплексу. Последняя 13-мерная последовательность L, наиболее удаленная от этого бокса ДНК, в конечном итоге разматывается, когда ее окружает хеликаза DnaB. Это образует репликационный пузырь для продолжения репликации ДНК. ^{[ 2 ]}

Археи используют более простой гомолог комплекса распознавания эукариотического происхождения , чтобы найти начало репликации, в последовательностях, называемых полем распознавания начала (ORB). ^{[ 9 ]}

Благоприятность

Раскручивание этих трех DUE является необходимым шагом для инициации репликации ДНК. Дистанционное притяжение от плавления дуплекса в последовательности бокса ДНК-это то, что индуцирует дальнейшее плавление в сайтах M и R DUE. Затем более удаленный сайт L раскручивается за счет связывания DnaB. Раскручивание этих 13-мерных сайтов не зависит от oriC-связывающих белков. Именно возникновение отрицательной суперспирали вызывает раскручивание. ^{[ 2 ]}

Скорость раскручивания ДНК в трех DUE E. coli экспериментально сравнивали с помощью спектроскопии ядерного резонанса. В физиологических условиях эффективность открытия каждой из последовательностей, богатых АТ, отличалась друг от друга. Во многом из-за разных отдаленно окружающих последовательностей. ^{[ 2 ]}

Кроме того, было обнаружено, что плавление пар оснований AT/TA происходит намного быстрее, чем плавление пар GC/CG (15–240 с). ⁻¹ против ~20 с. ⁻¹). Это подтверждает идею о том, что последовательности AT имеют эволюционное преимущество в элементах DUE из-за их легкости раскручивания. ^{[ 2 ]}

Последовательность консенсуса

Три 13-мерные последовательности, идентифицированные как DUE в E. coli , хорошо консервативны в начале репликации всех документированных кишечных бактерий . Общая консенсусная последовательность была получена путем сравнения консервативных бактерий с образованием последовательности из 11 оснований. ГАТЦТТТТТТ . E. coli содержит 9 оснований консенсусной последовательности из 11 оснований в своем oriC в пределах 13-мерных последовательностей. Эти последовательности обнаруживаются исключительно в одном месте начала репликации; а не где-либо еще в последовательности генома. ^{[ 2 ]}

Эукариоты

Механизмы репликации эукариот работают аналогично механизмам репликации прокариот, но находятся под более тонкой регуляцией. ^{[ 10 ]} Необходимо гарантировать, что каждая молекула ДНК реплицируется только один раз и что это происходит в нужном месте и в нужное время. ^{[ 7 ]} Действует в ответ на внеклеточные сигналы, которые координируют начало деления, по-разному в разных тканях. Внешние сигналы запускают репликацию в S-фазе посредством продукции циклинов , которые активируют циклин-зависимые киназы (CDK) с образованием комплексов. ^{[ 10 ]}

Репликация ДНК у эукариот инициируется после связывания комплекса распознавания происхождения (ORC) с источником. Это происходит в G1 _, фазе клетки служащей для перехода клеточного цикла в фазу S. Это связывание позволяет в дальнейшем связывать факторы для создания пререпликативного комплекса (пре-RC). Pre-RC инициируется, когда с ним связываются циклинзависимая киназа (CDK) и Dbf4-зависимая киназа (DDK). Затем инициирующие комплексы позволяют рекрутировать активатор хеликазы MCM Cdc45 и последующее раскручивание дуплекса в начале. ^{[ 10 ]}^{[ 11 ]}

Репликация у эукариот инициируется в нескольких участках последовательности, одновременно образуя несколько вилок репликации . Такая эффективность необходима для больших геномов, которые им необходимо реплицировать. ^{[ 10 ]}

У эукариот нуклеосомные структуры могут затруднять инициацию репликации. ^{[ 4 ]} Они могут блокировать доступ DUE-B к DUE, подавляя тем самым инициацию транскрипции. ^{[ 4 ]} Может помешать скорости. Однако линейная природа эукариотической ДНК по сравнению с прокариотической кольцевой ДНК облегчает раскручивание ее дуплекса, если он правильно размотан из нуклеосомы. ^{[ 4 ]} Активность DUE можно модулировать факторами транскрипции, такими как ABF1. ^{[ 4 ]}

Дрожжи

Распространенной модельной системой дрожжей, которая хорошо представляет репликацию эукариот, является Saccharomyces cerevisiae . ^{[ 12 ]} Он обладает автономно реплицирующими последовательностями (ARS), которые хорошо трансформируются и сохраняются в плазмиде. Считается, что некоторые из этих ARS действуют как точки начала репликации. Эти ARS состоят из трех доменов A, B и C. Домен A — это место, где согласован ARS. ^{[ 5 ]} Последовательность находится, придумал ACS. Домен B содержит DUE. Наконец, домен C необходим для облегчения белок-белковых взаимодействий . ^{[ 12 ]} ARS обнаружены распределенными по 16 хромосомам, повторяющимися каждые 30–40 т.п.н. ^{[ 12 ]}

У разных видов эти последовательности ARS вариабельны, но их домены A, B и C хорошо консервативны. ^{[ 12 ]} Любые изменения в DUE (домен B) приводят к снижению общей функции ARS в целом при инициации репликации. Это было обнаружено в ходе исследований с использованием иминообмена и ЯМР-спектроскопии . ^{[ 2 ]}

Млекопитающие

На сегодняшний день DUE обнаружены в некоторых источниках репликации млекопитающих. В общем, очень мало источников репликации у млекопитающих были хорошо проанализированы, поэтому трудно определить, насколько распространены DUE в их определенных источниках репликации. ^{[ 5 ]}

Человеческие клетки до сих пор имеют очень мало подробностей об их происхождении. ^{[ 5 ]} Известно, что репликация инициируется в больших областях зоны инициации, связанных с известными белками, такими как ген c-myc и β-глобин. Считается, что клетки с DUE действуют почти так же, как дрожжевые клетки. ^{[ 5 ]}

, связанный с происхождением плазмид в клетках млекопитающих, Обнаружено, что SV40 связан с гексамером T-ag, который вызывает противоположную суперспирализацию для увеличения благоприятности раскручивания цепи. ^{[ 4 ]}

Млекопитающие с DUE продемонстрировали способность к структурообразованию, которая обеспечивает одноцепочечную стабильность раскрученной ДНК. К ним относятся крестоформы , внутримолекулярные триплексы и многое другое. ^{[ 5 ]}

DUE-связывающие белки

Белки элементов раскручивания ДНК (DUE-B) обнаружены у эукариот. ^{[ 3 ]}

Они действуют, инициируя разделение цепей путем связывания с DUE. ^{[ 3 ]} Гомологи последовательности DUE-B обнаружены у различных видов животных: рыб, амфибий и грызунов. ^{[ 3 ]} DUE-B имеют неупорядоченные C-концевые домены, которые связываются с DUE путем узнавания этого C-конца. ^{[ 3 ]} Никакая другая специфичность последовательности не участвует в этом взаимодействии. ^{[ 3 ]} Подтверждено индуцированием мутаций по длине последовательности DUE-B, но во всех случаях способность к димеризации остается неизменной. ^{[ 3 ]} При связывании ДНК С-конец становится упорядоченным, что обеспечивает большую устойчивость к деградации протеазой . ^{[ 3 ]} Всего DUE-B состоит из 209 остатков, 58 из которых неупорядочены до тех пор, пока не связываются с DUE. ^{[ 3 ]} DUE-B гидролизует АТФ, чтобы функционировать. ^{[ 3 ]} Также обладают последовательностью, сходной с аминоацил-тРНК-синтетазой , и ранее были классифицированы как таковые. ^{[ 13 ]} DUE-B образуют гомодимеры , которые создают расширенную вторичную структуру бета-листа, проходящую через него. ^{[ 3 ]} Два из этих гомодимеров собираются вместе, образуя общую асимметричную структуру DUE-B. ^{[ 3 ]}

При формировании пре-RC Cdc45 локализуется в DUE и проявляет активность посредством взаимодействия с DUE-B. ^{[ 11 ]} Разрешение дуплексного раскручивания и инициации репликации. ^{[ 11 ]}

У людей DUE-B на 60 аминокислот длиннее, чем его дрожжевые аналоги -ортологи . ^{[ 13 ]} Оба локализуются преимущественно в ядре. ^{[ 13 ]}

Уровни DUE-B находятся в постоянном количестве, независимо от клеточного цикла. ^{[ 13 ]} Однако в S-фазе DUE-B могут временно фосфорилироваться, чтобы предотвратить преждевременную репликацию. ^{[ 13 ]} Активность DUE-B контролируется ковалентно. ^{[ 13 ]} Сборка этих DUE-B в регионах DUE зависит от локальной активности киназы и фосфатазы. ^{[ 13 ]} DUE-B также могут подавляться siRNA и участвуют в расширенных стадиях G1 . ^{[ 13 ]}

Последствия мутации

Мутации, нарушающие раскручивание сайтов DUE, непосредственно препятствуют активности репликации ДНК. ^{[ 14 ]} Это может быть результатом делеций/изменений в области DUE, добавления реактивных реагентов или добавления специфической нуклеазы . ^{[ 4 ]} Однако сайты DUE относительно нечувствительны к точечным мутациям , сохраняя свою активность при изменении оснований в сайтах связывания белков. ^{[ 4 ]} Во многих случаях активность DUE можно частично восстановить за счет повышения температуры. ^{[ 4 ]} Также можно восстановить, повторно добавив сайт DUE. ^{[ 3 ]}

Если существует достаточно серьезная мутация DUE, из-за которой он больше не связывается с DUE-B, Cdc45 не может ассоциироваться и не будет связываться с фактором транскрипции c-myc. Это можно восстановить с помощью расширения длины последовательности DUE, связанного с заболеванием (ATTCT)(n). Если активность DUE восстановится в избытке, это может привести к нарушению регуляции образования источника и прогрессированию клеточного цикла. ^{[ 11 ]}

У эукариот, когда DUE-B нокаутированы, клетка не переходит в S-фазу своего цикла, где происходит репликация ДНК. усиление апоптоза . Результатом станет ^{[ 3 ]} Но активность можно спасти повторным добавлением DUE-B, даже от другого вида. Это связано с тем, что DUE-B гомологичны между видами. ^{[ 3 ]} Например, если DUE-B в яйце Xenopus мутирует, репликация ДНК не произойдет, но ее можно спасти путем добавления HeLa DUE-B для восстановления полной функциональности. ^{[ 3 ]}

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^б Ковальски Д., Эдди М.Дж. (декабрь 1989 г.). «Элемент раскручивания ДНК: новый цис-действующий компонент, который облегчает открытие точки начала репликации Escherichia coli» . Журнал ЭМБО . 8 (13): 4335–44. дои : 10.1002/j.1460-2075.1989.tb08620.x . ПМК 401646 . ПМИД 2556269 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я Коман Д., Руссу И.М. (май 2005 г.). «Открытие пары оснований в трех элементах, раскручивающих ДНК» . Журнал биологической химии . 280 (21): 20216–21. дои : 10.1074/jbc.M502773200 . ПМИД 15784615 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я ^дж ^к ^л ^м ^н ^тот ^п ^д Кемп М., Бае Б., Ю Дж.П., Гош М., Леффак М., Наир С.К. (апрель 2007 г.). «Структура и функция белка DUE-B, связывающего элемент ДНК c-myc» . Журнал биологической химии . 282 (14): 10441–8. дои : 10.1074/jbc.M609632200 . ПМИД 17264083 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я ^дж ^к ^л ^м ДеПамфилис М.Л. (1993). «Репликация эукариотической ДНК: анатомия происхождения». Ежегодный обзор биохимии . 62 (1): 29–63. дои : 10.1146/annurev.bi.62.070193.000333 . ПМИД 8352592 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я Потаман В.Н., Питлос М.Дж., Хашем В.И., Бисслер Дж.Дж., Леффак М., Синден Р.Р. (2006). Уэллс Р.Д., Асидзава Т. (ред.). Генетическая нестабильность и неврологические заболевания (второе изд.). Берлингтон: Академическая пресса. стр. 447–460. дои : 10.1016/B978-012369462-1/50031-4 . ISBN 9780123694621 .
^ Натале Д.А., Шуберт А.Е., Ковальски Д. (апрель 1992 г.). «Спиральная стабильность ДНК объясняет мутационные дефекты в начале репликации дрожжей» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 89 (7): 2654–8. Бибкод : 1992PNAS...89.2654N . дои : 10.1073/pnas.89.7.2654 . ПМК 48720 . ПМИД 1557369 .
^ Jump up to: ^а ^б Зискинд Дж.В., Смит Д.В. (2001). Бреннер С., Миллер Дж. Х. (ред.). Энциклопедия генетики . Нью-Йорк: Академическая пресса. стр. 1381–1387. дои : 10.1006/rwgn.2001.0938 . ISBN 9780122270802 .
^ Чодаварапу С., Кагуни Дж. М. (01 января 2016 г.). «Инициация репликации у бактерий». В Кагуни Л.С., Оливейра М.Т. (ред.). Ферменты . Репликация ДНК среди таксонов. Том. 39. Академическая пресса. стр. 1–30. дои : 10.1016/bs.enz.2016.03.001 . ISBN 9780128047354 . ПМК 5551690 . ПМИД 27241926 .
^ Белл СД (2012). «Архейные белки Orc1/Cdc6». Эукариотическая реплисома: руководство по структуре и функциям белка . Субклеточная биохимия. Том. 62. С. 59–69. дои : 10.1007/978-94-007-4572-8_4 . ISBN 978-94-007-4571-1 . ПМИД 22918580 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д Бхагаван, Невада; Ха, Чон Ын (2015). Основы медицинской биохимии (второе изд.). Сан-Диего: Академическая пресса. стр. 401–417. ISBN 9780124166875 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д Чоудхури А., Лю Г., Кемп М., Чен Х, Катранги Н., Майерс С., Гош М., Яо Дж., Гао Ю., Бубуля П., Леффак М. (март 2010 г.). «Белок DUE-B, связывающий элемент раскручивания ДНК, взаимодействует с Cdc45 при образовании преинициативного комплекса» . Молекулярная и клеточная биология . 30 (6): 1495–507. дои : 10.1128/MCB.00710-09 . ПМЦ 2832489 . ПМИД 20065034 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д Дхар М.К., Сегал С., Каул С. (май 2012 г.). «Структура, эффективность репликации и хрупкость дрожжевых элементов ARS». Исследования в области микробиологии . 163 (4): 243–53. дои : 10.1016/j.resmic.2012.03.003 . ПМИД 22504206 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час Каспер Дж. М., Кемп М. Г., Гош М., Рэндалл Г. М., Вайлант А., Леффак М. (апрель 2005 г.). «Белок, связывающий элемент раскручивания ДНК c-myc, модулирует сборку комплексов репликации ДНК in vitro» . Журнал биологической химии . 280 (13): 13071–83. дои : 10.1074/jbc.M404754200 . ПМИД 15653697 .
^ Умек Р.М., Ковальски Д. (ноябрь 1990 г.). «Элемент раскручивания ДНК в точке начала репликации дрожжей функционирует независимо от легко раскручивающихся последовательностей, присутствующих в других местах плазмиды» . Исследования нуклеиновых кислот . 18 (22): 6601–5. дои : 10.1093/нар/18.22.6601 . ПМК 332616 . ПМИД 2174542 .

[:02-1] Jump up to: ^а ^б Ковальски Д., Эдди М.Дж. (декабрь 1989 г.). «Элемент раскручивания ДНК: новый цис-действующий компонент, который облегчает открытие точки начала репликации Escherichia coli» . Журнал ЭМБО . 8 (13): 4335–44. дои : 10.1002/j.1460-2075.1989.tb08620.x . ПМК 401646 . ПМИД 2556269 .

[:102-2] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я Коман Д., Руссу И.М. (май 2005 г.). «Открытие пары оснований в трех элементах, раскручивающих ДНК» . Журнал биологической химии . 280 (21): 20216–21. дои : 10.1074/jbc.M502773200 . ПМИД 15784615 .

[:12-3] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я ^дж ^к ^л ^м ^н ^тот ^п ^д Кемп М., Бае Б., Ю Дж.П., Гош М., Леффак М., Наир С.К. (апрель 2007 г.). «Структура и функция белка DUE-B, связывающего элемент ДНК c-myc» . Журнал биологической химии . 282 (14): 10441–8. дои : 10.1074/jbc.M609632200 . ПМИД 17264083 .

[:22-4] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я ^дж ^к ^л ^м ДеПамфилис М.Л. (1993). «Репликация эукариотической ДНК: анатомия происхождения». Ежегодный обзор биохимии . 62 (1): 29–63. дои : 10.1146/annurev.bi.62.070193.000333 . ПМИД 8352592 .

[:72-5] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я Потаман В.Н., Питлос М.Дж., Хашем В.И., Бисслер Дж.Дж., Леффак М., Синден Р.Р. (2006). Уэллс Р.Д., Асидзава Т. (ред.). Генетическая нестабильность и неврологические заболевания (второе изд.). Берлингтон: Академическая пресса. стр. 447–460. дои : 10.1016/B978-012369462-1/50031-4 . ISBN 9780123694621 .

[:6-6] Натале Д.А., Шуберт А.Е., Ковальски Д. (апрель 1992 г.). «Спиральная стабильность ДНК объясняет мутационные дефекты в начале репликации дрожжей» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 89 (7): 2654–8. Бибкод : 1992PNAS...89.2654N . дои : 10.1073/pnas.89.7.2654 . ПМК 48720 . ПМИД 1557369 .

[:9-7] Jump up to: ^а ^б Зискинд Дж.В., Смит Д.В. (2001). Бреннер С., Миллер Дж. Х. (ред.). Энциклопедия генетики . Нью-Йорк: Академическая пресса. стр. 1381–1387. дои : 10.1006/rwgn.2001.0938 . ISBN 9780122270802 .

[8] Чодаварапу С., Кагуни Дж. М. (01 января 2016 г.). «Инициация репликации у бактерий». В Кагуни Л.С., Оливейра М.Т. (ред.). Ферменты . Репликация ДНК среди таксонов. Том. 39. Академическая пресса. стр. 1–30. дои : 10.1016/bs.enz.2016.03.001 . ISBN 9780128047354 . ПМК 5551690 . ПМИД 27241926 .

[#22918580-9] Белл СД (2012). «Архейные белки Orc1/Cdc6». Эукариотическая реплисома: руководство по структуре и функциям белка . Субклеточная биохимия. Том. 62. С. 59–69. дои : 10.1007/978-94-007-4572-8_4 . ISBN 978-94-007-4571-1 . ПМИД 22918580 .

[:8-10] Jump up to: ^а ^б ^с ^д Бхагаван, Невада; Ха, Чон Ын (2015). Основы медицинской биохимии (второе изд.). Сан-Диего: Академическая пресса. стр. 401–417. ISBN 9780124166875 .

[:1-11] Jump up to: ^а ^б ^с ^д Чоудхури А., Лю Г., Кемп М., Чен Х, Катранги Н., Майерс С., Гош М., Яо Дж., Гао Ю., Бубуля П., Леффак М. (март 2010 г.). «Белок DUE-B, связывающий элемент раскручивания ДНК, взаимодействует с Cdc45 при образовании преинициативного комплекса» . Молекулярная и клеточная биология . 30 (6): 1495–507. дои : 10.1128/MCB.00710-09 . ПМЦ 2832489 . ПМИД 20065034 .

[:0-12] Jump up to: ^а ^б ^с ^д Дхар М.К., Сегал С., Каул С. (май 2012 г.). «Структура, эффективность репликации и хрупкость дрожжевых элементов ARS». Исследования в области микробиологии . 163 (4): 243–53. дои : 10.1016/j.resmic.2012.03.003 . ПМИД 22504206 .

[:5-13] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час Каспер Дж. М., Кемп М. Г., Гош М., Рэндалл Г. М., Вайлант А., Леффак М. (апрель 2005 г.). «Белок, связывающий элемент раскручивания ДНК c-myc, модулирует сборку комплексов репликации ДНК in vitro» . Журнал биологической химии . 280 (13): 13071–83. дои : 10.1074/jbc.M404754200 . ПМИД 15653697 .

[:4-14] Умек Р.М., Ковальски Д. (ноябрь 1990 г.). «Элемент раскручивания ДНК в точке начала репликации дрожжей функционирует независимо от легко раскручивающихся последовательностей, присутствующих в других местах плазмиды» . Исследования нуклеиновых кислот . 18 (22): 6601–5. дои : 10.1093/нар/18.22.6601 . ПМК 332616 . ПМИД 2174542 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]