Определение концов транс-сплайсированной экзонной РНК

Определение концов транссплайсированной экзонной РНК (TEC-RED) представляет собой транскриптомный метод , который, как и SAGE , позволяет осуществлять цифровое обнаружение последовательностей информационной РНК. В отличие от SAGE, обнаружение и очистка транскриптов с 5'-конца информационной РНК требуют присутствия транс-сплайсированной лидерной последовательности.

Транссплайсинг

Сплайсированные лидерные последовательности представляют собой короткие последовательности некодирующей РНК , не встречающиеся внутри самого гена и прикрепленные к 5'-концу всех или части мРНК, транскрибируемых в организме. Было обнаружено, что у нескольких видов они ответственны за разделение полицистронных транскриптов на мРНК одного гена , а у других за сплайсинг с моноцистронными транскриптами. ^[1] Основная роль транс-сплайсинга моноцистронных транскриптов в значительной степени неизвестна. ^[2] Было высказано предположение, что они могут действовать как независимый промотор, который способствует тканеспецифичной экспрессии независимых изоформ белка. ^[3] Сплайсированные лидеры наблюдались у трипаносоматид, эвглены , плоских червей, Caenorhabditis . ^[1]^[4] Некоторые виды содержат только одну сплайсированную лидерную последовательность, обнаруженную на всех мРНК. У C. elegans их два, они обозначены SL1 и SL2 . ^[5]

Методы TEC-RED

Тотальную РНК очищают из интересующего образца. поли А Информационная РНК затем очищается от тотальной РНК и затем транслируется в кДНК с использованием реакции обратной транскрипции. кДНК , полученную из мРНК, метят с использованием праймеров, гомологичных сплайсированным лидерным последовательностям организма. В девятистадийной реакции ПЦР кДНК одновременно встраиваются в сайт эндонуклеазы рестрикции BpmI (хотя может работать любая эндонуклеаза рестрикции класса II) и биотиновую метку, которая присутствует в праймерах. Эти меченые кДНК затем расщепляются на 14 п.о. ниже сайта узнавания с помощью эндонуклеазы рестрикции BpmI и затупляют концы ДНК-полимеразой Т4. Фрагменты дополнительно очищаются от постороннего материала ДНК с помощью биотиновых меток для связывания их со стрепдавидиновой матрицей. Затем их лигируют с адаптерной ДНК в шести отдельных реакциях, содержащих шесть различных сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции. Эти метки затем амплифицируются с помощью ПЦР с праймерами, содержащими несоответствие, заменяющее сайт Bpm1 на сайт Xho1. Ампликоны объединяются и лигированный в плазмидный вектор . Затем клональные векторы секвенируют и картируют в геноме. ^[6]

Конкатенация

Объединение тегов, разработанное в 2004 году, отличается от того, что наблюдалось в SAGE. Расщепление меток с помощью Xho1 и смешивание различных образцов с последующим лигированием образуют первый этап конкатенации. На втором этапе используется одна из эндонуклеаз рестрикции, согласованная с молекулой-адаптером, прикрепленной к 3'-концу. Их снова лигируют и ПЦР проводят для очистки образцов для следующего соединения. Конкатенацию продолжают со второй эндонуклеазой рестрикции, за ней следует третья и, наконец, четвертая. В результате образуется конкатамер, образованный шестью эндонуклеазными лигациями, содержащими 32 метки, расположенные с 5' на 5' вокруг сайта Xho1. ^[6] В SAGE конкатенация происходит после того, как дитаги сформированы и амплифицированы с помощью ПЦР. Линкеры на внешней стороне дитагов расщепляются ферментом, обеспечивающим их связывание, и эти дитаги с липкими концами случайным образом объединяются и помещаются в вектор клонирования. ^[7]

Преимущества

Преимущество TEC-RED перед SAGE заключается в том, что для первоначального связывания линкера не требуется эндонуклеаза рестрикции. Это предотвращает систематическую ошибку, связанную с последовательностями сайтов рестрикции, которые отсутствуют в некоторых генах, как это видно в SAGE. Возможность иметь снимок конкретных изоформ РНК позволяет сделать вывод о дифференциальной регуляции изоформ посредством альтернативного выбора промоторов. ^[8] Это также может помочь в распознавании паттернов экспрессии, уникальных для последовательностей SL1 или SL2. TEC-RED также позволяет охарактеризовать 5'-концы продуцируемой РНК и, следовательно, изоформы, которые отличаются аминоконцевым сплайсингом. Эта технология позволяет определять и проверять все известные и неизвестные гены, которые можно предсказать, а также 5'-изоформы сплайсинга или 5'-концы РНК, которые могут быть получены. Использование TEC-RED в сочетании с SAGE или модифицированным протоколом позволит распознавать 5'- и 3'-концы транскриптов соответственно. Таким образом, возможна идентификация альтернативных вариантов сплайсинга и, возможно, относительных количеств, содержащих транс-сплайсированную лидерную последовательность.

Вариации

Были описаны два альтернативных метода, которые позволяют проводить анализ 5'-меток в организмах, не имеющих транс-сплайсированных лидерных последовательностей. Методы, представленные Toshiyuki et al. и Син-ичи и др. называются CAGE и 5' SAGE соответственно. CAGE использует технологию биотинилированного кэп-трэппера для поддержания сигнала мРНК достаточно долго для создания и отбора кДНК полной длины , которые имеют адаптерные последовательности, лигированные на 5'-конце. 5' SAGE использует технологию олигокэпирования. ^[9] Оба используют свою адаптерную последовательность для прайминга после кДНК создания . Однако оба этих метода имеют недостатки. CAGE продемонстрировал, что метки с добавлением гуанина в первое положение и олигокэпирование могут привести к смещению последовательности из-за использования РНК-лигазы. ^[10]

См. также

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^б Риддл, Дональд Л. (1997). К. Элеганс II . Плейнвью, Нью-Йорк: Лабораторное издательство Колд-Спринг-Харбор. ISBN 978-0-87969-532-3 .
^ Лалл С., Фридман К.С., Янковска-Анышка М., Степински Дж., Дажинкевич Э., Дэвис Р.Э. (октябрь 2004 г.). «Вклад транс-сплайсинга, длины 5'-лидера, синергизма кэп-поли(А) и факторов инициации в трансляцию нематод в бесклеточной системе эмбриона Ascaris suum» . Ж. Биол. Хим . 279 (44): 45573–85. дои : 10.1074/jbc.M407475200 . ПМИД 15322127 .
^ Чой Дж., Ньюман А.П. (август 2006 г.). «Двухпромоторная система экспрессии генов у C. elegans». Дев. Биол . 296 (2): 537–44. дои : 10.1016/j.ydbio.2006.04.470 . ПМИД 16765937 .
^ Нильсен Т.В. (декабрь 2001 г.). «Эволюционное происхождение транс-сплайсинга с добавлением SL: все еще загадка». Тенденции Жене . 17 (12): 678–80. дои : 10.1016/S0168-9525(01)02499-4 . ПМИД 11718904 .
^ Хуан XY, Хирш Д. (ноябрь 1989 г.). «Вторая транссплайсированная лидерная последовательность РНК у нематоды Caenorhabditis elegans» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 86 (22): 8640–4. Бибкод : 1989PNAS...86.8640H . дои : 10.1073/pnas.86.22.8640 . ПМК 298343 . ПМИД 2813415 .
^ Jump up to: ^а ^б Хван Б.Дж., Мюллер Х.М., Штернберг П.В. (февраль 2004 г.). «Аннотация генома путем высокопроизводительного определения конца 5'-РНК» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 101 (6): 1650–5. Бибкод : 2004PNAS..101.1650H . дои : 10.1073/pnas.0308384100 . ПМК 341809 . ПМИД 14757812 .
^ Велкулеску В.Е., Чжан Л., Фогельштейн Б., Кинцлер К.В. (октябрь 1995 г.). «Серийный анализ экспрессии генов». Наука . 270 (5235): 484–7. Бибкод : 1995Sci...270..484В . дои : 10.1126/science.270.5235.484 . ПМИД 7570003 . S2CID 16281846 .
^ Печчи А., Вьегас Л.Р., Баранао Дж.Л., Беато М. (июнь 2001 г.). «Выбор промотора влияет на альтернативный сплайсинг и определяет баланс изоформ, экспрессируемых мышиным геном bcl-X» . Ж. Биол. Хим . 276 (24): 21062–9. дои : 10.1074/jbc.M008665200 . ПМИД 11274164 .
^ Сузуки Ю, Ёситомо-Накагава К, Маруяма К, Суяма А, Сугано С (октябрь 1997 г.). «Создание и характеристика библиотеки кДНК, обогащенной по полной длине и по 5'-концу». Джин . 200 (1–2): 149–56. дои : 10.1016/S0378-1119(97)00411-3 . ПМИД 9373149 .
^ Харберс М., Карнинчи П. (июль 2005 г.). «Подходы на основе тегов для исследования транскриптома и аннотации генома». Нат. Методы . 2 (7): 495–502. дои : 10.1038/nmeth768 . ПМИД 15973418 . S2CID 24186981 .

Карнинчи П., Квам С., Китамура А. и др. (ноябрь 1996 г.). «Высокоэффективное клонирование полноразмерной кДНК с помощью биотинилированного CAP-ловца». Геномика . 37 (3): 327–36. дои : 10.1006/geno.1996.0567 . ПМИД 8938445 .
Хашимото С., Сузуки Ю., Касаи Ю. и др. (сентябрь 2004 г.). «5'-конец SAGE для анализа сайтов начала транскрипции». Нат. Биотехнология . 22 (9): 1146–9. дои : 10.1038/nbt998 . ПМИД 15300261 . S2CID 5485989 .
Шираки Т., Кондо С., Катаяма С. и др. (декабрь 2003 г.). «Экспрессия генов Cap-анализа для высокопроизводительного анализа начальной точки транскрипции и идентификации использования промотора» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 100 (26): 15776–81. Бибкод : 2003PNAS..10015776S . дои : 10.1073/pnas.2136655100 . ПМК 307644 . ПМИД 14663149 .
Зорио Д.А., Ченг Н.Н., Блюменталь Т., Спит Дж. (ноябрь 1994 г.). «Опероны как распространенная форма хромосомной организации у C. elegans». Природа . 372 (6503): 270–2. Бибкод : 1994Natur.372..270Z . дои : 10.1038/372270a0 . ПМИД 7969472 . S2CID 4257343 .

Внешние ссылки

Теги CAGE http://genome.gsc.riken.jp/absolute/
5' Результаты SAGE https://archive.today/20040821030224/http://5sage.gi.ku-tokyo.ac.jp/ " https://archive.today/20040821030224/http://5sage.gi.ku -tokyo.ac.jp/
Теги TEC RED, встречающиеся в базе червей https://web.archive.org/web/20080909025225/http://www.wormbase.org/db/searches/advanced/dumper

[Riddle97-1] Jump up to: ^а ^б Риддл, Дональд Л. (1997). К. Элеганс II . Плейнвью, Нью-Йорк: Лабораторное издательство Колд-Спринг-Харбор. ISBN 978-0-87969-532-3 .

[2] Лалл С., Фридман К.С., Янковска-Анышка М., Степински Дж., Дажинкевич Э., Дэвис Р.Э. (октябрь 2004 г.). «Вклад транс-сплайсинга, длины 5'-лидера, синергизма кэп-поли(А) и факторов инициации в трансляцию нематод в бесклеточной системе эмбриона Ascaris suum» . Ж. Биол. Хим . 279 (44): 45573–85. дои : 10.1074/jbc.M407475200 . ПМИД 15322127 .

[3] Чой Дж., Ньюман А.П. (август 2006 г.). «Двухпромоторная система экспрессии генов у C. elegans». Дев. Биол . 296 (2): 537–44. дои : 10.1016/j.ydbio.2006.04.470 . ПМИД 16765937 .

[4] Нильсен Т.В. (декабрь 2001 г.). «Эволюционное происхождение транс-сплайсинга с добавлением SL: все еще загадка». Тенденции Жене . 17 (12): 678–80. дои : 10.1016/S0168-9525(01)02499-4 . ПМИД 11718904 .

[5] Хуан XY, Хирш Д. (ноябрь 1989 г.). «Вторая транссплайсированная лидерная последовательность РНК у нематоды Caenorhabditis elegans» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 86 (22): 8640–4. Бибкод : 1989PNAS...86.8640H . дои : 10.1073/pnas.86.22.8640 . ПМК 298343 . ПМИД 2813415 .

[Hwang04-6] Jump up to: ^а ^б Хван Б.Дж., Мюллер Х.М., Штернберг П.В. (февраль 2004 г.). «Аннотация генома путем высокопроизводительного определения конца 5'-РНК» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 101 (6): 1650–5. Бибкод : 2004PNAS..101.1650H . дои : 10.1073/pnas.0308384100 . ПМК 341809 . ПМИД 14757812 .

[7] Велкулеску В.Е., Чжан Л., Фогельштейн Б., Кинцлер К.В. (октябрь 1995 г.). «Серийный анализ экспрессии генов». Наука . 270 (5235): 484–7. Бибкод : 1995Sci...270..484В . дои : 10.1126/science.270.5235.484 . ПМИД 7570003 . S2CID 16281846 .

[8] Печчи А., Вьегас Л.Р., Баранао Дж.Л., Беато М. (июнь 2001 г.). «Выбор промотора влияет на альтернативный сплайсинг и определяет баланс изоформ, экспрессируемых мышиным геном bcl-X» . Ж. Биол. Хим . 276 (24): 21062–9. дои : 10.1074/jbc.M008665200 . ПМИД 11274164 .

[9] Сузуки Ю, Ёситомо-Накагава К, Маруяма К, Суяма А, Сугано С (октябрь 1997 г.). «Создание и характеристика библиотеки кДНК, обогащенной по полной длине и по 5'-концу». Джин . 200 (1–2): 149–56. дои : 10.1016/S0378-1119(97)00411-3 . ПМИД 9373149 .

[10] Харберс М., Карнинчи П. (июль 2005 г.). «Подходы на основе тегов для исследования транскриптома и аннотации генома». Нат. Методы . 2 (7): 495–502. дои : 10.1038/nmeth768 . ПМИД 15973418 . S2CID 24186981 .

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]