Фотоакустическая проточная цитометрия

Фотоакустическая проточная цитометрия или PAFC — это метод биомедицинской визуализации, который использует фотоакустическую визуализацию для выполнения проточной цитометрии . Поток клеток проходит через фотоакустическую систему, вырабатывающую индивидуальный сигнальный ответ. Каждый сигнал подсчитывается для количественной оценки входного образца.

Описание

Традиционная проточная цитометрия использует клетки в ламинарном потоке одного файла, который затем проходит через источник света. Использование различных количественных оценок рассеяния света клетками позволяет системе количественно определять размер и сложность клеток, что в конечном итоге может быть использовано при количественной оценке клеточного состава в образце. Фотоакустическая проточная цитометрия работает по аналогичным принципам, но использует фотоакустический сигнал для дифференциации клеточных структур. Кроме того, проточная цитометрия обеспечивает отличный анализ ex vivo , но из-за чистого оптического источника глубина проникновения ограничена, что ограничивает анализ in vivo . Альтернативно, фотоакустика может обеспечить преимущество перед проточной цитометрией, поскольку она принимает акустический сигнал, а не оптический, и может проникать на большую глубину, как обсуждается далее в принципах работы и математике.

Фотоакустический (ПА) эффект был открыт Александром Беллом в 1880 году и возникает, когда источник фотонов поглощается оптически воспринимающим веществом, производящим ультразвуковую волну. Сила создаваемой ультразвуковой волны является функцией интенсивности поглощенного фотона и врожденных свойств освещаемого вещества. Каждое интересующее вещество поглощает фотоны определенной длины волны, в результате чего только определенные вещества изначально производят сигнал PA на данной длине волны. Например, гемоглобин и меланин — два распространенных биологических вещества, которые производят сильные сигналы PA в ответ на лазерные импульсы в диапазоне длин волн 680 нм. Спектр поглощения PA находится в пределах видимого электромагнитного спектра, что делает визуализацию PA безызлучательной по своей природе. Удельный спектр поглощения может быть как ограничением, так и преимуществом визуализации PA (подробнее см. В приложениях).

В системах обычно используется Nd:YAG (иттрий-алюминиевый гранат, легированный неодимом) или светодиодная лазерная система, которая импульсно проникает в интересующую биологическую ткань. С каждым импульсом, соприкасающимся с тканью, генерируется сигнал PA в виде ультразвуковой волны. Эта ультразвуковая волна распространяется через ткань, пока не достигнет ультразвукового преобразователя и создаст линию А-линии. Выделяют максимальную амплитуду каждой a-линии, и ее значение наносят на график зависимости времени от амплитуды, создавая график цитометрии.

Принципы работы и математика

Производство тепла

Фотоакустическая проточная цитометрия работает по принципу фотоакустического эффекта, при котором лазер видимого спектра вызывает повышение температуры и, следовательно, тепловое расширение. Уравнение теплового расширения в зависимости от интенсивности лазерного излучения для пульсирующего лазера описано ниже.

$H(z,t)=\mu _{a}I_{0}e^{-\omega t}$

Где $\mu _{a}$ – коэффициент поглощения фокусированного уравнения, $I_{0}$ – интенсивность лазера, ⍵ – частота лазерного импульса, t – время. $e^{-i\omega t}$ описывается как показательное выражение синусоидальной функции, определяемой формулой Эйлера . Важно отметить, что глубина проникновения лазера ограничена диффузионным режимом, который зависит от затухания в ткани перед облучением биологической мишени.

Фотоакустическая волновая связь

Ниже устанавливается соотношение тепла и давления для фотоакустического сигнала.

$[\nabla ^{2}-{1 \over \nu _{s}}{\partial \over \partial t^{2}}]p(z,t)=-{\beta \over C_{p}}{\partial H \over \partial t}$

Где ∇ - система дифференциальных уравнений в частных производных с пространственной связью, $\nu _{s}$ – скорость звука в интересующем веществе, t – время, $p(z,t)$ - давление как функция времени и пространства, β - коэффициент теплового расширения, $C_{p}$ - удельная теплоемкость, а ${\partial H \over \partial t}$ является частным дифференциалом уравнения теплопроводности, описанного выше.

Левая часть уравнения описывает уравнение волны давления, которое получено для моделирования ультразвукового уравнения волны давления . Правая часть уравнения определяет связь выделения тепла с тепловым расширением, приводящим к волне давления.

Решение волны давления

Хотя реальность создает трехмерную волну, которая распространяется через ткань, для целей PAFC необходимая информация относится только к одномерному анализу. Ниже демонстрируется одномерное решение с помощью импульсного лазера.

$p(z,t)={\mu _{a}\beta F\nu _{s}^{2} \over 2C_{p}}{\hat {h}}(z,t)$

Где $\mu _{a}$ – коэффициент поглощения, – коэффициент теплового расширения, $C_{p}$ - удельная теплоемкость, F - плотность энергии лазера, $\nu _{s}$ скорость звука в данном материале и ${\hat {h}}(z,t)$ – полная энергия, полученная от лазерного импульса.

Важно отметить, что при длительном лазерном воздействии волновое уравнение становится в значительной степени функцией интенсивности лазера. Для целей анализа сигнала ПА лазерный импульс должен быть коротким по времени, чтобы генерировать сигнал, величина которого варьируется в зависимости от свойств облучаемого вещества, чтобы дифференцировать интересующие цели. Различия в создаваемой волне давления являются основой разделения сигналов в PAFC.

Обнаружение сигнала

Пример PAFC, где эритроциты производят красный сигнал меньшей амплитуды. Подсчет амплитуд синего цвета показывает одну синюю ячейку в образце.

Создаваемая волна давления имеет форму ультразвуковой волны. Волна распространяется через материал и обнаруживается ультразвуковым преобразователем. Давление измеряется с помощью пьезоэлектрических кристаллов, которые преобразуют давление в изменение напряжения, т. е. амплитуда сигнала пропорциональна значению давления в любой момент времени. Это напряжение отображается как функция времени и приводит к образованию ранее описанной линии.

Временные данные важны для других типов фотоакустической визуализации, но для целей PAFC в качестве точки данных извлекается максимальная амплитуда в пределах прямой линии. Для каждого лазерного импульса это максимальное значение амплитуды отображается в зависимости от времени, обеспечивая отслеживание сигнала проточной цитометрии. Каждая линия представляет собой лазерный импульс, а его амплитуда отражает облучаемую цель. Выбрав диапазон амплитуд, который является репрезентативным для определенного типа клеток, можно подсчитать сигналы и, таким образом, количественно оценить типы клеток в данном образце. На рисунке 1 показана анимация потока ячеек и типичное отслеживание сигнала PAFC.

Приложения

Бактерии

Ежегодно в Соединенных Штатах происходит более двух миллионов бактериальных инфекций. С ростом устойчивости к антибиотикам лечение этих инфекций становится все труднее, поэтому правильный выбор антибиотиков становится все более важным. Оптимальный выбор антибиотика зависит от способности определять бактерии-возбудители. Традиционно видообразование бактерий определяют с помощью технологий культивирования и ПЦР . Эти технологии занимают не менее 48 часов, а иногда и больше. Из-за длительных сроков видообразования поставщики должны выбирать антибиотики широкого спектра действия. PAFC можно использовать для обнаружения бактерий в крови для более своевременного подбора антибиотиков.

Первым шагом в обнаружении с помощью PAFC является маркировка бактерий, чтобы у них был сигнал PA для обнаружения. Обычно он состоит из красителя и способа прикрепления красителя к интересующим бактериям. Хотя антитела использовались и раньше, бактериофаги оказались более дешевыми и стабильными в производстве. Многочисленные исследования показали специфичность отбора бактериофагов для интересующих бактерий, особенно MRSA , E. Coli и сальмонеллы . Красители различаются, но чаще всего используются наночастицы золота , индоцианин зеленый (ICG) и красный краситель 81. Красители производят усиленный сигнал, обеспечивающий более чувствительное обнаружение. Пределы обнаружения, установленные в одном исследовании, показали примерно 1 бактериальную клетку на 0,6 мкм. ³ . Конкретные красители были протестированы на животных на токсичность и не привели к каким-либо явным повреждениям. Хотя исследования на людях по обнаружению бактерий в крови еще не проводились, PAFC может сыграть роль в будущих приложениях обнаружения бактерий.

Малярия

Малярия ежегодно уносит жизни 0,4 миллиона человек во всем мире. При использовании современных лекарств раннее выявление является ключом к предотвращению этих смертей. Современные методы включают микроскопическое обнаружение в мазках крови , серологическое исследование или ПЦР. Лаборантам может не хватать опыта, или технологии могут быть слишком дорогими для определенных учреждений, что неизбежно приведет к пропуску диагностики. Кроме того, современные методы, как правило, не позволяют выявить малярию при концентрации паразитов <50 на микролитр, и для обнаружения требуется 3–4 дня после заражения. Таким образом, существует потребность в более автоматизированном и чувствительном методе обнаружения для улучшения результатов лечения пациентов.

PAFC доказала, что пределы обнаружения намного ниже, чем у нынешних методов. Одно исследование продемонстрировало чувствительность одного паразита в 0,16 мл циркулирующей крови и, таким образом, его можно обнаружить на 1-2 день после инокуляции. Кроме того, исследования продемонстрировали возможность обнаружения in vivo, исключая возможность ошибочного диагноза из-за поврежденных клеток, полученных при экстракции крови и in vitro . анализе PAFC обнаруживает малярию с помощью суррогатного маркера гемозоина, продукта распада, вырабатываемого малярией на стадии мерозоита . Гемозоин является отличной фотоакустической мишенью и сильно реагирует на длины волн в диапазоне 671 нм и 820 нм. Хотя фоновые сигналы производятся гемоглобином внутри эритроцитов , инфицированные эритроциты (iRBC) гемозоином производят сильный сигнал, превышающий уровень гемоглобина на этих длинах волн. В методах in vitro для обнаружения используются капиллярные трубки диаметром 50 микрометров и потоком 1 см/с (in vitro). Напротив, Меняев и др. продемонстрировали обнаружение малярии in vivo. Детекцию проводили на поверхностных и глубоких сосудах мышей. Поверхностные сосуды обеспечивают более высокое соотношение сигнал/шум (SNR), но менее сравнимы с сосудами человека. артерии мышей Яремные вены и сонные по размеру аналогичны мелким сосудам человека, которые продемонстрировали более высокие артефакты из-за пульсации крови и дыхательных изменений, но их можно объяснить.

Хотя PAFC обеспечивает более чувствительный предел обнаружения, этот метод имеет некоторые ограничения. Как упоминалось ранее, обнаружение гемозоина происходит только тогда, когда паразиты находятся на стадии мерозоита. Это ограничивает временные рамки обнаружения паразитов по сравнению с обнаружением на стадии трофозоита , но все же обеспечивает более раннее обнаружение, чем существующие методы. Во-вторых, протестированные до сих пор размеры сосудов применялись только на мышах. Артефакты более глубокого анализа сосудов у людей могут снизить чувствительность PAFC, что сделает предел обнаружения менее полезным, чем предполагается в настоящее время. Хотя проблемы все еще существуют, PAFC может сыграть роль в улучшении диагностики малярии у людей.

Циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК)

Циркулирующие опухолевые клетки или ЦОК — это опухолевые клетки, которые оторвались от первичной опухоли и перемещаются в крови. Эти ЦОК затем засевают отдаленные участки, что приводит к метастазам . Метастазы являются причиной 90% смертей, связанных с раком, и поэтому выявление ЦОК имеет решающее значение для профилактики метастазов. Исследования показали, что более раннее обнаружение ЦОК улучшает лечение и, следовательно, увеличивает продолжительность выживаемости. (15) Современные методы обнаружения включают , среди прочего, RT-PCR , проточную цитометрию, оптическое зондирование, фильтрацию по размеру клеток. Эти методы ограничены из-за размера выборки взятой крови (~ 5–10 мл), что приводит к пределу обнаружения ЦОК ~ 10 ЦОК/мл. Для получения результатов с помощью этих методов требуется от нескольких часов до нескольких дней, что может привести к задержке начала лечения.

PAFC может сыграть роль в будущем обнаружении ЦОК. Чтобы предотвратить ограничение отбора проб небольшого объема из-за забора крови у пациента, PAFC использует метод in vivo для мониторинга большего объема крови (т.е. всего объема). Исследование продемонстрировало мониторинг аорты мыши, они смогли визуализировать весь объем крови мыши в течение 1 минуты после обнаружения.

ЦОК, такие как меланомы, содержат собственный хромофор и не требуют маркировки для обнаружения на фоне гемоглобина. Другие опухолевые клетки (например, плоскоклеточные раковые клетки) можно пометить наночастицами, чтобы создать более сильный сигнал PA по сравнению с эритроцитами для их обнаружения. Эти методы привели к улучшению предела обнаружения ЦОК. Де ла Зерда и др. обнаружили ЦОК всего через 4 дня после инокуляции раковых клеток. Их предел обнаружения был определен как 1 CTC/мл, что означает 10-кратное улучшение чувствительности. Кроме того, маркировка наночастицами оказалась нетоксичной, и для оптимального мечения ЦОК потребовалось всего 10 минут.

Это обнаружение ЦОК может быть использовано для скрининга метастазов, но также имеет терапевтические последствия. Было установлено, что во время резекции опухоли или манипуляций эти манипуляции высвобождают ЦОК. PAFC можно использовать как способ мониторинга высвобождения этих ЦОК, которые затем могут потребовать систематического лечения. Из-за нелинейного термоупругого воздействия лазера на ЦОК/наночастицы более высокая плотность энергии лазера может привести к разрыву ЦОК без повреждения местных эритроцитов. Снижение содержания ЦОК может улучшить лечение системными методами или полностью устранить необходимость в нем.

Хотя существует большой потенциал для применения, все еще есть области для улучшения. Во-первых, PAFC ограничена по глубине и тестировалась только на поверхностной коже человека, что может представлять трудности для более центральных опухолей, таких как легкие или кишечник. Во-вторых, хотя первоначальные модели на мышах показали эффективность маркировки наночастицами, маркировку конкретных типов рака и побочные эффекты красителей необходимо более глубоко изучить, чтобы гарантировать безопасность этого метода визуализации.