Число целостности РНК
Число целостности РНК (RIN) — это алгоритм присвоения значений целостности измерениям РНК .
Целостность РНК является серьезной проблемой при изучении экспрессии генов и традиционно оценивается с использованием соотношения 28S и 18S рРНК , метод, который оказался противоречивым. [ 1 ] 28S и 18S необходима субъективная, человеческая интерпретация Это несоответствие возникает из-за того, что для сравнения изображений геля . Алгоритм RIN был разработан для решения этой проблемы. Алгоритм RIN применяется для электрофоретических измерений РНК, обычно получаемых с помощью электрофореза в капиллярном геле и основанных на сочетании различных функций, которые предоставляют информацию о целостности РНК, чтобы обеспечить более универсальный метод измерения. В исследованиях, сравнивающих его с другими алгоритмами расчета целостности РНК, было продемонстрировано, что RIN является надежным и воспроизводимым, что укрепляет его позиции в качестве предпочтительного метода определения качества анализируемой РНК. [ 2 ]
Основная критика RIN возникает при его использовании с растениями или в исследованиях взаимодействия эукариотических и прокариотических клеток. Алгоритм RIN не способен дифференцировать эукариотические / прокариотические / хлоропластические рибосомальные РНК, что приводит к серьезной недооценке индекса качества в таких ситуациях.
Терминология
[ редактировать ]Электрофорез — это процесс разделения видов нуклеиновых кислот в зависимости от их длины путем приложения к ним электрического поля. Поскольку нуклеиновые кислоты заряжены отрицательно, они проталкиваются электрическим полем через матрицу, обычно агарозный гель, при этом более мелкие молекулы продвигаются дальше и быстрее. [ 3 ] Капиллярный электрофорез — это метод, при котором небольшие количества образца нуклеиновой кислоты можно нанести на гель в очень тонкой пробирке. В машине есть детектор, который может определить, когда образцы нуклеиновой кислоты проходят через определенную точку пробирки, причем первыми проходят образцы меньшего размера. Это может дать электрофореграмму, подобную той, что показана на рисунке 1, где длина связана со временем, за которое образцы проходят через детектор.
Маркер — это образец известного размера, который перемещается вместе с образцом, так что фактический размер остальной части образца можно узнать путем сравнения расстояния/времени их пробега относительно этого маркера.
РНК — это биологическая макромолекула, состоящая из сахаров и азотистых оснований , которая играет ряд важнейших ролей во всех живых клетках. Существует несколько подтипов РНК, наиболее распространенными в клетке являются тРНК (транспортная РНК), рРНК (рибосомальная РНК) и мРНК (информационная РНК). Все три из них участвуют в процессе трансляции , причем наиболее известными видами (~85%) клеточной РНК являются рРНК. В результате это вид, который наиболее сразу виден при анализе РНК с помощью электрофореза и, таким образом, используется для определения качества РНК (см. «Вычисления» ниже). рРНК бывает разных размеров: у млекопитающих они относятся к размерам 5S, 18S и 28S. 28S и 5S рРНК образуют большую субъединицу, а 18S — малую субъединицу рибосомы — молекулярного механизма, ответственного за синтез белков. [ 4 ]
Приложения
[ редактировать ]РНКазы распространены повсеместно и часто могут загрязнять и впоследствии разлагать образцы РНК в лаборатории, поэтому целостность РНК может быть очень легко нарушена, что приводит к появлению ряда лабораторных методов, разработанных для устранения их воздействия. [ 5 ] [ 6 ] Однако эти методы не являются надежными, и поэтому образцы все равно могут быть разложены, что требует метода измерения целостности РНК, чтобы гарантировать достоверность и воспроизводимость молекулярных анализов, поскольку целостность РНК имеет решающее значение для получения правильных результатов в исследованиях экспрессии генов, таких как микроматричный анализ, нозерн-блоттинг или количественная ПЦР в реальном времени (кПЦР). [ 7 ] [ 8 ] Деградированная РНК оказывает прямое влияние на расчетные уровни экспрессии, часто приводя к значительному снижению кажущейся экспрессии. [ 9 ]
qPCR и подобные методы очень дороги, требуют много времени и денег, поэтому продолжаются исследования, направленные на снижение стоимости при сохранении точности и воспроизводимости qPCR для экспрессии генов и других приложений. [ 10 ] Оценка RIN позволяет ученому оценить достоверность и воспроизводимость эксперимента, прежде чем нести существенные затраты на проведение исследований экспрессии генов.
RIN — это стандартный метод измерения целостности РНК, который можно использовать для оценки качества РНК, полученной с помощью новых методов выделения РНК. [ 11 ]
Разработка
[ редактировать ]Поскольку уже давно известно, что целостность РНК является проблемой в исследованиях молекулярной биологии, существует несколько методов, которые исторически использовались для определения целостности РНК. Наиболее популярным уже давно является электрофорез в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием , позволяющий визуализировать полосы пиков рРНК. Высоту полос 28S и 18S можно сравнить друг с другом, при этом соотношение 2:1 указывает на недеградированную РНК. [ 1 ] Хотя этот метод очень дешев и прост, у этого метода есть несколько проблем, в первую очередь его субъективность, приводящая к непоследовательным, нестандартизированным оценкам качества РНК, а также к большим количествам РНК, необходимым для ее визуализации на агарозном геле, что может быть проблематично, если РНК не так много, с которой можно работать. [ 1 ] [ 12 ] Существует также ряд различных проблем, которые могут возникнуть при электрофорезе в агарозном геле, таких как плохая загрузка, неравномерное прохождение и неравномерное окрашивание, которые приводят к увеличению вариабельности точности использования электрофореза в агарозном геле для определения целостности РНК. [ 13 ]
Показатель целостности РНК был разработан компанией Agilent Technologies в 2005 году. [ 1 ] Алгоритм был создан путем взятия сотен образцов, после чего специалисты вручную присвоили им всем значения от 1 до 10 в зависимости от их целостности, причем 10 — наивысшее значение. Инструменты адаптивного обучения, использующие байесовский метод обучения , использовались для создания алгоритма, который мог бы прогнозировать RIN, преимущественно с использованием функций, перечисленных ниже в разделе «Вычисления». [ 1 ] [ 14 ] Это позволяет всему программному обеспечению Agilent генерировать один и тот же RIN для данного образца РНК, стандартизируя измерения и делая их гораздо менее субъективными, чем предыдущие методы. [ нужна ссылка ] .
Вычисление
[ редактировать ]
RIN для образца рассчитывается с использованием нескольких характеристик электрофореграммы РНК, причем наиболее значимыми являются первые две, перечисленные ниже. RIN присваивает электрофорограмме значение от 1 до 10, где 10 соответствует наименьшему ухудшению качества. Все следующие описания применимы к РНК млекопитающих, поскольку РНК других видов имеют разные размеры рРНК: [ 1 ] Общее соотношение РНК рассчитывается путем отношения площади под пиками 18S и 28S рРНК к общей площади под графиком. Здесь желательно большое число, указывающее на то, что большая часть рРНК все еще имеет эти размеры и, следовательно, практически отсутствует. произошла деградация. Идеальное соотношение можно увидеть на рисунке 1, где почти вся РНК находится на пиках 18S и 28S РНК.
Для высоты пика 28S желательно большое значение. 28S, наиболее известный вид рРНК, используется при расчете RIN, поскольку он обычно разлагается быстрее, чем 18S рРНК, и поэтому измерение высоты ее пика позволяет обнаружить ранние стадии деградации. Опять же, это видно на рисунке 1, где пик 28S является самым большим, и это хорошо.
Быстрая область — это область между пиками 18S и 5S рРНК на электрофореграмме. Первоначально, когда значение соотношения быстрых площадей увеличивается, это указывает на деградацию 18S и 28S рРНК до промежуточного размера, хотя впоследствии это соотношение уменьшается по мере дальнейшей деградации РНК до еще меньших размеров. Таким образом, низкое значение не обязательно указывает на хорошую или плохую целостность РНК.
Желательна небольшая высота маркера, указывающая на то, что только небольшое количество РНК подверглось деградации и достигло наименьшей длины, на что указывает короткий маркер. Если здесь обнаружено большое количество, это указывает на то, что большие количества рРНК разложились на мелкие кусочки, которые можно было бы обнаружить ближе к этому маркеру. Эту ситуацию можно увидеть на электрофореграмме РНК «низкого качества», представленной на рисунке 2, где высота пика над маркером (крайний левый) очень велика, поэтому РНК сильно деградировала. В прокариотических образцах алгоритм несколько иной, но программное обеспечение Agilent 2100 Bioanalyzer Expert теперь может рассчитывать RIN и для прокариотических образцов. [ 15 ] Разница, вероятно, возникает из-за того, что, хотя в образцах млекопитающих преобладающими видами являются 28S и 18S рибосомальные РНК, прокариотические РНК имеют размеры, сдвинутые немного меньше, к 23S и 16S, поэтому алгоритм должен быть изменен, чтобы учесть это. Еще одним важным фактом при расчете показателей целостности прокариотической РНК является то, что RIN не был проверен в такой степени, как для эукариотической РНК. [ 15 ] Было показано, что более высокие значения RIN коррелируют с лучшими последующими результатами у эукариот, но для прокариот это не делалось так широко, поэтому для прокариот это может означать меньшее значение.
Эти электрофореграммы для расчета RIN выполняются с использованием аппарата Agilent Bioanalyzer, который способен выполнять электрофорез и генерировать электрофореграммы. [ 14 ] Программное обеспечение Agilent 2100 обладает уникальными возможностями выполнения программного обеспечения RIN, поскольку точный алгоритм является запатентованным, поэтому в его расчетах используются дополнительные важные функции электрофореграммы РНК, которые не являются общедоступными.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Перейти обратно: а б с д и ж Шредер, Андреас; Мюллер, Одило; Стокер, Сюзанна; Саловский, Рюдигер; Лейбер, Майкл; Гассманн, Маркус; Лайтфут, Самар; Мензель, Вольфрам; Гранцов, Мартин; Рэгг, Томас (2006). «RIN: номер целостности РНК для присвоения значений целостности измерениям РНК» . BMC Молекулярная биология . 7 (1): 3. дои : 10.1186/1471-2199-7-3 . ПМЦ 1413964 . ПМИД 16448564 .
- ^ Имбо, Сандрин; Грауденс, Эстер; Буланже, Вирджиния; Барлет, Ксавье; Заборски, Патрик; Эвено, Эрик; Мюллер, Одило; Шредер, Андреас; Офре, Чарльз (1 января 2005 г.). «К стандартизации оценки качества РНК с использованием независимых от пользователя классификаторов следов микрокапиллярного электрофореза» . Исследования нуклеиновых кислот . 33 (6): е56. дои : 10.1093/nar/gni054 . ISSN 0305-1048 . ПМЦ 1072807 . ПМИД 15800207 .
- ^ Уотсон, Джеймс Д.; Бейкер, Таня А.; Белл, Стивен П.; Ганн, Александр; Левин, Майкл; Лосик, Ричард (2014). Молекулярная биология гена: седьмое издание . Гленвью, Иллинойс: Pearson Education. ISBN 978-0-321-85149-9 .
- ^ Хаттер, Хина; Мясников Александр Георгиевич; Натчиар, С. Кундхавай; Клахольц, Бруно П. (2015). «Структура рибосомы 80S человека». Природа . 520 (7549): 640–645. Бибкод : 2015Natur.520..640K . дои : 10.1038/nature14427 . ПМИД 25901680 . S2CID 4459012 .
- ^ «Как избежать заражения рибонуклеазой | NEB» . www.neb.com . Проверено 10 апреля 2016 г.
- ^ «Основы: контроль РНКазы» . www.thermofisher.com . Проверено 10 апреля 2016 г.
- ^ Бастин, Стивен А.; Бенеш, Владимир; Гарсон, Джереми А.; Хеллеманс, Ян; Хаггетт, Джим; Кубиста, Микаэль; Мюллер, Рейнхольд; Нолан, Таня; Пфаффл, Майкл В. (1 апреля 2009 г.). «Руководство MIQE: Минимальная информация для публикации количественных экспериментов по ПЦР в реальном времени» . Клиническая химия . 55 (4): 611–622. дои : 10.1373/clinchem.2008.112797 . ISSN 0009-9147 . ПМИД 19246619 .
- ^ Флейге, Симона; Пфаффл, Майкл В. (2006). «Целостность РНК и влияние на эффективность QRT-ПЦР в реальном времени». Молекулярные аспекты медицины . 27 (2–3): 126–139. дои : 10.1016/j.mam.2005.12.003 . ПМИД 16469371 .
- ^ Тейлор, Шон С.; Мркусич, Эли М. (2014). «Состояние RT-количественной ПЦР: непосредственные наблюдения за внедрением минимальной информации для публикации экспериментов по количественной ПЦР в реальном времени (MIQE)» . Журнал молекулярной микробиологии и биотехнологии . 24 (1): 46–52. дои : 10.1159/000356189 . ПМИД 24296827 .
- ^ Райтшулер, Кристоф; Линс, Филипп; Илмер, Пол (2014). «Оценка праймера и адаптация для экономичного QPCR на основе SYBR Green и его применимость для конкретного количественного определения метаногенов». Всемирный журнал микробиологии и биотехнологии . 30 (1): 293–304. дои : 10.1007/s11274-013-1450-x . ПМИД 23918633 . S2CID 36790110 .
- ^ Ливингстон, Уитни С.; Раш, Хизер Л.; Нерсесян, Паула В.; Бакстер, Тристин; Мысливец, Винсент; Гилл, Джессика М. (01 января 2015 г.). «Улучшение сна у военнослужащих связано с изменением экспрессии воспалительных генов и улучшением симптомов депрессии» . Границы в психиатрии . 6:59 . дои : 10.3389/fpsyt.2015.00059 . ПМЦ 4415307 . ПМИД 25983695 .
- ^ Тейлор, Шон; Уэйкем, Майкл; Дейкман, Грег; Альсаррадж, Марван; Нгуен, Мари (01 апреля 2010 г.). «Практический подход к RT-qPCR — публикация данных, соответствующих рекомендациям MIQE». Методы . Продолжающаяся эволюция qPCR. 50 (4): С1–С5. дои : 10.1016/j.ymeth.2010.01.005 . ПМИД 20215014 .
- ^ «Развитие методологии контроля качества для оценки выделенной общей РНК и полученной фрагментированной кРНК», Примечание по применению Agilent, номер публикации 5988-9861EN, 2003.
- ^ Перейти обратно: а б «Номер целостности РНК (RIN) – стандартизация контроля качества РНК», Рекомендации по применению Agilent, номер публикации 5989-1165EN, 2016 г.
- ^ Перейти обратно: а б Биоанализатор Agilent 2100: Руководство пользователя для экспертов 2100 . Вальдбронн, Германия: Agilent Technologies (2005).
Внешние ссылки
[ редактировать ]- Информация RIN от Agilent Technologies
- Статья RIN в BMC Molecular Biology
- Краткое изложение экспрессии генов от природы, чтобы показать, почему нам нужен RIN
- Объяснение RIN от Agilent Technologies с несколькими примерами электрофореграмм при различных значениях RIN.
- Моделирование гель-электрофореза из Университета Юты, чтобы помочь визуализировать, как создаются электрофореграммы.