Тракционная силовая микроскопия
В клеточной биологии микроскопия силы тяги ( TFM ) представляет собой экспериментальный метод определения тяги на поверхности клетки путем измерения окружающего поля смещения внутри (ECM) in vitro внеклеточного матрикса .
Обзор
[ редактировать ]Известно, что динамическое механическое поведение клеток-ECM и межклеточных взаимодействий влияет на широкий спектр клеточных функций, включая некроз, дифференцировку , адгезию , миграцию , локомоцию и рост . TFM использует экспериментально наблюдаемые смещения ЕСМ для расчета силы тяги или вектора напряжения на поверхности клетки. До TFM исследователи наблюдали натяжение клеток на субстратах из силиконовой резины, сморщивающихся вокруг клеток; [ 1 ] однако точная количественная оценка тракций при таком методе затруднена из-за нелинейного и непредсказуемого поведения складок. Несколько лет спустя терминология TFM была введена для описания более сложной вычислительной процедуры, которая была создана для преобразования измерений деформации подложки в расчетные напряжения растяжения. [ 2 ]
Общая методология
[ редактировать ]В обычном TFM клеточные культуры высевают на или внутри оптически прозрачного 3D ECM, встроенного в флуоресцентные микросферы (обычно латексные шарики диаметром от 0,2 до 1 мкм ). [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] Для этой цели можно использовать широкий спектр природных и синтетических гидрогелей при условии, что механическое поведение материала хорошо охарактеризовано, а гидрогель способен поддерживать жизнеспособность клеток. Клетки будут прилагать свои собственные силы к этому субстрату, что, следовательно, сместит шарики в окружающий ЕСМ. В некоторых исследованиях детергент , фермент или лекарство используется для нарушения цитоскелета , тем самым изменяя, а иногда и полностью устраняя тяги, генерируемые клеткой.
Сначала вычисляется непрерывное поле смещения на основе пары изображений: первое изображение представляет собой эталонную конфигурацию микросфер, окружающих изолированную клетку, а второе изображение представляет собой ту же изолированную клетку, окруженную микросферами, которые теперь смещены из-за генерируемого клеткой поля. тяги. Конфокальная флуоресцентная микроскопия обычно используется для изображения поверхности клеток и флуоресцентных шариков. После расчета поля поступательного смещения между деформированной и недеформированной конфигурацией можно вычислить поле деформации. По полю деформаций можно рассчитать поле напряжений, окружающее клетку, зная поведение напряжения и деформации или конститутивную модель окружающего материала гидрогеля. Можно сделать еще один шаг и использовать поле напряжений для расчета тяги на поверхности клетки, если векторы нормали к поверхности клетки можно получить из набора трехмерных изображений . Хотя эта процедура является распространенным способом получения клеточного тяги за счет смещения микросфер, в некоторых исследованиях успешно использовался обратный вычислительный алгоритм для получения поля тяги. [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ]
Ограничения
[ редактировать ]Пространственное разрешение поля тяги, которое можно восстановить с помощью TFM, ограничено количеством измерений смещения на площадь. [ 11 ] Расстояние между независимыми измерениями смещения варьируется в зависимости от экспериментальных установок, но обычно составляет порядка одного микрометра. Паттерны тяги, создаваемые клетками, часто содержат локальные максимумы и минимумы меньшего размера. Обнаружение этих тонких изменений локальной клеточной тракции с помощью TFM остается сложной задачей.
Достижения
[ редактировать ]В 2D TFM клетки культивируются в виде монослоя на поверхности тонкой подложки с настраиваемой жесткостью, а микросферы вблизи поверхности подложки подвергаются деформации за счет связей клетка-ECM. Культуры клеток 2.5D аналогичным образом выращивают поверх тонкого слоя ЕСМ, а разбавленные структурные белки ЕСМ смешивают со средой, добавляемой над клетками и субстратом. Хотя большая часть плодотворной работы в TFM была выполнена в 2D или 2,5D, многие типы клеток требуют сложных биофизических и биохимических сигналов от 3D ECM, чтобы вести себя действительно физиологически реалистично в среде in vitro . [ 12 ]
Когда вращение или растяжение субобъема велико, в расчет силы натяжения клеточной поверхности могут быть внесены ошибки, поскольку большинство методов TFM используют вычислительную структуру, основанную на линейной упругости. Недавние достижения в области TFM показали, что клетки способны проявлять деформации с величиной деформации до 40%, что требует использования подхода теории конечной деформации для учета больших величин деформации. [ 13 ]
Приложения
[ редактировать ]Хотя TFM часто используется для наблюдения за тракцией на поверхности пространственно изолированной отдельной клетки, вариация TFM также может использоваться для анализа коллективного поведения многоклеточных систем. Например, скорости клеточной миграции и плитотаксис наблюдаются вместе с вычисленной картой изменения напряжения однослойного листа клеток с помощью подхода, называемого монослойной стрессовой микроскопией. [ 14 ] Механическое поведение отдельных клеток по сравнению со сливающимся слоем клеток отличается тем, что монослой находится в состоянии «перетягивания каната». Имеются также данные о перераспределении тракций, которое может происходить раньше, чем изменения полярности клеток и миграции. [ 15 ]
оказался особенно полезным для изучения дуротаксиса TFM также .
Недавно TFM был применен для изучения механизма раковых клеток инвазии с гипотезой о том, что клетки, генерирующие большую тягу, более инвазивны, чем клетки с более низкой тягой. [ 16 ] Также есть надежда, что недавние результаты TFM будут способствовать разработке оптимальных каркасов для тканевой инженерии и регенерации периферической нервной системы . [ 17 ] трансплантация артерий , [ 18 ] и эпителиальные клетки кожи. [ 19 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ АК Харрис, П. Уайлд и Д. Стопак. Субстраты из силиконовой резины: новый подход к изучению движения клеток Science 208(4440):177–179, 1980.
- ^ Муневар, С; Ван, Ю; Дембо, М (2001). «Тракционная силовая микроскопия мигрирующих нормальных и h-ras трансформированных фибробластов 3t3» . Биофизический журнал . 80 (4): 1744–1757. дои : 10.1016/s0006-3495(01)76145-0 . ПМК 1301364 . ПМИД 11259288 .
- ^ Маскаринец, SA; Франк, К; Тиррелл, Д.А.; Равичандран, Г. (2009). «Количественная оценка клеточных сил тяги в трех измерениях» . Труды Национальной академии наук . 106 (52): 22108–22113. дои : 10.1073/pnas.0904565106 . ПМЦ 2799761 . ПМИД 20018765 .
- ^ Франк, К; Хонг, С; Маскаринец, SA; Тиррелл, Д.А.; Равичандран, Г (2007). «Трехмерные полнопольные измерения больших деформаций мягких материалов с использованием конфокальной микроскопии и цифровой объемной корреляции». Экспериментальная механика . 47 (3): 427–438. дои : 10.1007/s11340-007-9037-9 . S2CID 137243239 .
- ^ Т.М. Кох, С. Мюнстер, Н. Бонакдар, Дж. П. Батлер и Б. Фабри. Трехмерные силы тяги при инвазии раковых клеток PLoS ONE 7(3):e33476, 2012
- ^ Легант, WR; Чой, СК; Миллер, Дж.С.; Шао, Л; Гао, Л; Бетциг, Э; Чен, CS (2013). «Многомерная микроскопия силы тяги выявляет вращательные моменты вне плоскости фокальных спаек» . Труды Национальной академии наук . 110 (3): 881–886. дои : 10.1073/pnas.1207997110 . ПМЦ 3549134 . ПМИД 23277584 .
- ^ «Тягово-силовая микроскопия» . cellmechanics.de .
- ^ М Дембо и И Ван. 1999 Напряжения на границе раздела клетка-субстрат во время движения фибробластов. Биофизический журнал, 76(4):2307–2316.
- ^ Легант, WR; Миллер, Дж.С.; Блейкли, Б.Л.; Коэн, DM; Генин, генеральный менеджер; Чен, CS (2010). «Измерение механических тяг, оказываемых клетками в трехмерных матрицах» . Природные методы . 7 (12): 969–971. дои : 10.1038/nmeth.1531 . ПМК 3056435 . ПМИД 21076420 .
- ^ Донг, Ли; Оберай, Асад А. (01 февраля 2017 г.). «Восстановление клеточной тяги в трехмерных нелинейных гиперупругих матрицах» . Компьютерные методы в прикладной механике и технике . Специальный выпуск о биологических системах, посвященный Уильяму С. Клугу. 314 : 296–313. дои : 10.1016/j.cma.2016.05.020 .
- ^ Сабасс, Б; Гардель, ML; Уотерман, CM; Шварц, США (2008 г.). «Микроскопия силы тяги высокого разрешения, основанная на экспериментальных и вычислительных достижениях» . Биофизический журнал . 94 (1): 207–220. дои : 10.1529/biophysj.107.113670 . ПМК 2134850 . ПМИД 17827246 .
- ^ Л.Г. Гриффит и М.А. Шварц. Захват сложной 3D-физиологии тканей in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 7(3):211–224, 2006 г.
- ^ Тойджанова Дж.; Бар-Кохба, Э; Лопес-Фагундо, Ц; Райхнер, Дж; Хоффман-Ким, Д; Франк, К. (2014). «Трёхмерная микроскопия силы тяги с высоким разрешением и большой деформацией» . ПЛОС ОДИН . 9 (4): е90976. дои : 10.1371/journal.pone.0090976 . ПМЦ 3989172 . ПМИД 24740435 .
- ^ Тамбе, Дхананджай Т. и др. «Коллективное управление клетками совместными межклеточными силами». Природные материалы 10.6 (2011): 469-475.
- ^ Муневар, Стивен, Ю-ли Ван и Мика Дембо. «Тракционная силовая микроскопия мигрирующих нормальных и трансформированных H-ras фибробластов 3T3». Биофизический журнал 80.4 (2001): 1744-1757.
- ^ Кох, Торстен М.; и др. (2012). «3D-тяговые силы при инвазии раковых клеток» . ПЛОС ОДИН . 7 (3): e33476. дои : 10.1371/journal.pone.0033476 . ПМЦ 3316584 . ПМИД 22479403 .
- ^ Лопес-Фагундо, Кристина; и др. (2014). «Трехмерные силы тяги шванновских клеток на податливых подложках» . Журнал интерфейса Королевского общества . 11 (97): 20140247. doi : 10.1098/rsif.2014.0247 . ПМК 4208357 . ПМИД 24872498 .
- ^ Джордж, JC и др. «Сократительная сила гладкомышечных миоцитов сосудов зависит от формы». Интегративная биология 6.2 (2014): 152-163.
- ^ Ведула, Шри Рам Кришна и др. «Эпителиальные мостики поддерживают целостность тканей во время коллективной миграции клеток». Природные материалы (2013).