✖


Jump to content

Иммуномаркировка

Иммуномечение - обнаружение антигена в ткани с помощью меченого антиген-специфического антитела

Иммуномечение — это биохимический процесс, который позволяет обнаружить и локализовать антиген в определенном месте внутри клетки, ткани или органа. Антигены — это органические молекулы, обычно белки , способные связываться с антителами . Эти антигены можно визуализировать с помощью комбинации антигенспецифических антител, а также средства обнаружения, называемого меткой, которое ковалентно связано с антителом. [1] Если процесс иммуномечения предназначен для раскрытия информации о клетке или ее субструктурах, этот процесс называется иммуноцитохимией . [2] Иммуномечение более крупных структур называется иммуногистохимией . [3]

Производство антител для иммуномечения состоит из двух сложных этапов. Первый — это производство антитела, которое специфически связывается с интересующим антигеном, а второй — слияние метки с антителом. Поскольку присоединить метку к каждому мыслимому антигенспецифическому антителу непрактично, в большинстве процессов иммуномаркирования используется непрямой метод обнаружения. В этом непрямом методе используется первичное антитело , специфичное к антигену, и вторичное антитело, слитое с меткой, которая специфически связывается с первичным антителом. Этот непрямой подход позволяет массово производить вторичные антитела, которые можно купить в готовом виде. [4] В соответствии с этим непрямым методом в тест-систему добавляют первичное антитело. Первичное антитело ищет целевой антиген и связывается с ним. Затем добавляют меченое вторичное антитело, предназначенное для прикрепления исключительно к первичному антителу.

Типичные метки включают: флуоресцентное соединение, золотые шарики, метку определенного эпитопа , [5] или фермент , производящий окрашенное соединение. Ассоциация меток с мишенью посредством антител обеспечивает идентификацию и визуализацию интересующего антигена в его нативном местоположении в ткани, например, клеточной мембране , цитоплазме или ядерной мембране . При определенных условиях метод можно адаптировать для получения количественной информации. [4]

Иммуномечение может использоваться в фармакологии , молекулярной биологии , биохимии и любой другой области, где важно знать точное местоположение молекулы, связывающейся с антителом. [6] [7] [8]

Косвенный и прямой метод

[ редактировать ]

Существует два метода иммуномечения: прямой и непрямой. При прямом методе иммуномечения первичное антитело конъюгируется непосредственно с меткой. [9] Прямой метод полезен для минимизации перекрестной реакции — меры неспецифичности, которая присуща всем антителам и умножается с каждым дополнительным антителом, используемым для обнаружения антигена. Однако прямой метод гораздо менее практичен, чем непрямой, и обычно не используется в лабораториях, поскольку первичные антитела должны быть ковалентно помечены, что требует большого количества очищенных антител. Кроме того, прямой метод потенциально гораздо менее чувствителен, чем косвенный метод. [10] Поскольку несколько вторичных антител способны связываться с разными частями или доменами одного первичного антитела, связывающего целевой антиген, с каждым антигеном связано больше меченых антител. Больше меток на антиген приводит к большему количеству сигнала на антиген. [11]

Для достижения высокой степени специфичности и чувствительности можно использовать различные непрямые методы. Во-первых, двухэтапные протоколы часто используются, чтобы избежать перекрестной реакции между иммуномечением нескольких смесей первичных и вторичных антител , где вторичные фрагменты антигенсвязывающих часто используются антител. Во-вторых, можно использовать гаптенилированные первичные антитела, где вторичное антитело может распознавать связанный гаптен . Гаптен ковалентно связан с первичным антителом с помощью сукцинилимидеэфиров или конъюгированных IgG Fc -специфичных участков Fab . Наконец, первичные моноклональные антитела , имеющие разные изотипы Ig, могут быть обнаружены с помощью специфических вторичных антител против изотипа . интересующего [10]

Связывание и специфичность антител

[ редактировать ]

В целом, антитела должны связываться с антигенами с высокой специфичностью и аффинностью. [12] Специфичность связывания относится к способности антитела связываться и связываться только с одним целевым антигеном. Ученые обычно используют моноклональные антитела и поликлональные антитела , которые состоят из синтетических пептидов. Во время производства этих антител антигенспецифические антитела изолируются путем присоединения антигенного пептида к аффинной колонке и обеспечения простого прохождения неспецифического антитела через колонку. Это снижает вероятность того, что антитела будут связываться с нежелательным эпитопом антигена, не обнаруженным в исходном пептиде. Следовательно, специфичность антитела устанавливается путем специфической реакции с белком или пептидом, который используется для иммунизации конкретными методами, такими как иммуноблоттинг или иммунопреципитация . [13]

При установлении специфичности антител ключевым фактором является тип используемых синтетических пептидов или очищенных белков. Чем меньше специфичность антитела, тем больше вероятность визуализации чего-то иного, чем целевой антиген. В случае синтетических пептидов преимущество заключается в том, что аминокислотная последовательность легко доступна, но пептиды не всегда напоминают трехмерную структуру или посттрансляционную модификацию, обнаруженную в нативной форме белка. Следовательно, антитела, которые производятся для работы против синтетического пептида, могут иметь проблемы с нативным трехмерным белком. Эти типы антител могут привести к плохим результатам в экспериментах по иммунопреципитации или иммуногистохимии , однако антитела могут быть способны связываться с денатурированной формой белка во время иммуноблоттинга. Напротив, если антитело хорошо работает с очищенными белками в их нативной форме и не денатурировано , иммуноблот нельзя использовать в качестве стандартизированного теста для определения специфичности связывания антитела, особенно в иммуногистохимии. [14]

Специфические методы иммуномечения

[ редактировать ]

Иммуномаркировка для световой микроскопии

[ редактировать ]

Световая микроскопия — это использование светового микроскопа , который представляет собой инструмент, требующий использования света для просмотра увеличенного образца. Обычно часто используется составной световой микроскоп, в котором две линзы, окуляр и объектив работают одновременно, обеспечивая увеличение образца. [15] Световая микроскопия часто использует иммуномечение для наблюдения за целевыми тканями или клетками. Например, было проведено исследование с целью изучения морфологии и продукции гормонов в культурах клеток аденомы гипофиза с помощью световой микроскопии и других методов электронной микроскопии. Этот тип микроскопии подтвердил, что первичные культуры клеток аденомы сохраняют свои физиологические характеристики in vitro , что соответствует гистологическому исследованию. Кроме того, клеточные культуры аденом гипофиза человека исследовали с помощью световой микроскопии и иммуноцитохимии, где эти клетки фиксировали и иммуномаркировали моноклональным мышиным антителом против человеческого ГР и поликлональным кроличьим антителом против ПРЛ. Это пример того, как иммуномеченная клеточная культура клеток аденомы гипофиза, которую изучали с помощью световой микроскопии и других методов электронной микроскопии, может помочь в правильной диагностике опухолей. [16]

Иммуномечение для электронной микроскопии

[ редактировать ]

Электронная микроскопия (ЭМ) — это целая область науки, в которой электронный микроскоп используется в качестве инструмента для наблюдения за тканями. [17] Электронная микроскопия имеет степень увеличения до 2 миллионов раз, тогда как световая микроскопия имеет увеличение только до 1000-2000 раз. [18] Существует два типа электронных микроскопов: просвечивающий электронный микроскоп и сканирующий электронный микроскоп . [17]

Электронная микроскопия — распространенный метод, в котором используется метод иммуномечения для просмотра меченых тканей или клеток. Метод электронного микроскопа следует многим из тех же концепций, что и иммуномечение для световой микроскопии, где конкретное антитело способно распознать местоположение интересующего антигена, а затем его можно просмотреть с помощью электронного микроскопа. Преимущество электронной микроскопии перед световой микроскопией заключается в возможности просматривать целевые области на субклеточном уровне. Обычно для ЭМ используется тяжелый металл с электронной плотностью, который может отражать падающие электроны. Иммуномаркировку обычно подтверждают с помощью светового микроскопа, чтобы убедиться в присутствии антигена, а затем проверяют с помощью электронного микроскопа. [19]

часто используются иммуномаркирование и электронная микроскопия Для просмотра хромосом . Было проведено исследование для рассмотрения возможных улучшений структур иммуномаркировки хромосом, таких как топоизомераза IIα и конденсин, в рассеченных митотических хромосомах. В частности, эти исследователи использовали УФ-облучение разделенных ядер или показали, как хромосомы помогают за счет высокого уровня специфической иммуномаркировки, которую можно было наблюдать с помощью электронной микроскопии. [20]

Иммуномечение для трансмиссионной электронной микроскопии

[ редактировать ]

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) использует просвечивающий электронный микроскоп для формирования двумерного изображения путем пропускания электронов через тонкий кусок ткани. Чем ярче определенные области на изображении, тем больше электронов могут перемещаться через образец. [17] Трансмиссионная электронная микроскопия использовалась как способ просмотра иммуномеченных тканей и клеток. Например, бактерии можно увидеть с помощью ПЭМ при применении иммуномаркировки. Было проведено исследование по изучению структуры фимбрий CS3 и CS6 у различных штаммов Escherichia coli , которые были обнаружены с помощью ПЭМ с последующим отрицательным окрашиванием и иммуномечением. Более конкретно, иммуномечение фимбрий подтвердило существование различных поверхностных антигенов. [21]

Иммуномаркировка для сканирующей электронной микроскопии

[ редактировать ]

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) использует сканирующий электронный микроскоп, который создает большие изображения, которые воспринимаются как трехмерные, хотя на самом деле это не так. Этот тип микроскопа концентрирует пучок электронов на очень маленькой площади (2-3 нм) образца, чтобы произвести электроны из этого образца. Эти вторичные электроны обнаруживаются датчиком, и изображение образца создается в течение определенного периода времени. [17]

Сканирующая электронная микроскопия является часто используемым методом иммуномечения. СЭМ способен обнаруживать поверхность клеточных компонентов в высоком разрешении. Этот метод иммуномечения очень похож на метод иммунофлуоресценции, но вместо флуорофора используется метка из коллоидного золота. В целом, концепции очень параллельны в том смысле, что используется неконъюгированное первичное антитело, за которым последовательно следует меченое вторичное антитело, которое действует против первичного антитела. [22] Иногда SEM в сочетании с иммуномечением частиц золота вызывает затруднения в отношении разрешения частиц и зарядов под электронным лучом; однако это снижение разрешения было решено за счет усовершенствования инструментов SEM с помощью визуализации обратно рассеянных электронов. [23] Это связано с тем, что картины дифракции обратно рассеянных электронов обеспечивают чистую поверхность образца для взаимодействия с первичным электронным пучком. [24]

Иммуномечение золотом (Immunogold Labeling)

[ редактировать ]

Иммуномечение частицами золота, также известное как окрашивание иммунозолотом , регулярно используется в сканирующей электронной микроскопии и трансмиссионной электронной микроскопии для успешной идентификации области внутри клеток и тканей, где расположены антигены. [23] Метод маркировки золотыми частицами был впервые опубликован Фолком В. и Тейлором Г., когда они смогли за один этап пометить частицы золота антисальмонеллезными кроличьими гамма-глобулинами, чтобы определить местоположение антигенов сальмонеллы. [23] [25]

Исследования показали, что размер частиц золота необходимо увеличить (> 40 нм), чтобы рассмотреть клетки при небольшом увеличении, но слишком большие частицы золота могут снизить эффективность связывания золотой метки. Ученые пришли к выводу, что использование более мелких частиц золота (1-5 нм) должно быть увеличено и усилено серебром. Хотя окрашивание тетраоксидом осмия может поцарапать серебро, было обнаружено, что усиление частиц золота не подвержено царапинам при окрашивании тетраоксидом осмия; следовательно, во многих исследованиях клеточной адгезии на различных субстратах можно использовать механизм мечения иммунозолотом за счет усиления частиц золота. [26]

Дальнейшие применения

[ редактировать ]

Были проведены исследования для проверки совместимости иммуномаркировки с отпечатками пальцев. Иногда отпечатки пальцев недостаточно четкие, чтобы распознать рисунок гребня. Иммуномаркировка может быть способом для судебно-медицинских экспертов сузить круг лиц, оставивших отпечаток. Исследователи провели исследование, в ходе которого проверялась совместимость иммуномаркирования со многими методами разработки отпечатков пальцев. Они обнаружили, что индандион-цинк (IND-ZnCl), IND-ZnCl с последующим распылением нингидрина (IND-NIN), физический проявитель (PD), дымление цианакрилата (CA), цианоакрилат с последующим основным желтым окрашиванием (CA-BY), люмицианоакрилат. дымление (Lumi-CA) и дымление полицианакрилата (Poly-CA) были совместимы с иммуномечением. [27] Иммуномаркировка может не только извлекать информацию о профиле донора из отпечатков пальцев, но также может повысить качество отпечатков пальцев, что будет полезно в судебно-медицинской экспертизе.

Ссылки

[ редактировать ]
  1. ^ Хаятт, А.Д. и Уайз, Т.Г. (2001). «Иммуномаркировка». Иммуноцитохимия и гибридизация in situ в биомедицинских науках . Бостон, Массачусетс: Биркхаузер Бостон. стр. 73–107. дои : 10.1007/978-1-4612-0139-7_5 . ISBN  978-1-46-12-0139-7 . {{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  2. ^ Нанси А., Вазен Р., Нишио С., Залзал С.Ф. (2008). «Иммуноцитохимия белков матрикса в кальцинированных тканях: функциональная биохимия на срезе» . Eur J Histochem . 52 (4): 201–14. дои : 10.4081/1218 . ПМИД   19109094 .
  3. ^ Суонсон PE (сентябрь 1988 г.). «Основы иммуногистохимии. Практический обзор» . Являюсь. Дж. Клин. Патол . 90 (3): 333–9. дои : 10.1093/ajcp/90.3.333 . ПМИД   3046324 .
  4. ^ Jump up to: а б Рэпли Р., Уокер Дж.М., ред. (2008). Справочник по молекулярным биометодам (2-е изд.). Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. п. 1066. ИСБН  978-1-60327-370-1 .
  5. ^ Пан Дж., Цзэн Икс, Сяо Р.П., Лакатта Э.Г., Линь Л. (июнь 2009 г.). «Разработка, создание и тестирование модулей экспрессии млекопитающих, которые метят мембранные белки» . Белковая наука . 18 (6): 1261–71. дои : 10.1002/pro.136 . ПМЦ   2774436 . ПМИД   19472344 .
  6. ^ Рэнгелл Л.К., Келлер Г.А. (август 2000 г.). «Применение микроволновой технологии для обработки и иммуномаркировки пластиковых и криосрезов» . Журнал гистохимии и цитохимии . 48 (8): 1153–9. дои : 10.1177/002215540004800812 . ПМИД   10898808 .
  7. ^ Малецки М., Сюй А., Труонг Л., Санчес С. (январь 2002 г.). «Молекулярное иммуномечение рекомбинантными антителами с одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv), созданными с металлсвязывающими доменами» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 99 (1): 213–8. Бибкод : 2002ПНАС...99..213М . дои : 10.1073/pnas.261567298 . ПМК   117541 . ПМИД   11756693 .
  8. ^ Хейкок JW (сентябрь 1989 г.). «Количественное определение тирозингидроксилазы, уровней белка: точечное иммуномечение аффинно-очищенным антителом». Аналитическая биохимия . 181 (2): 259–66. дои : 10.1016/0003-2697(89)90240-6 . ПМИД   2573292 .
  9. ^ Чендлер, Дуглас Э.; Роберсон, Роберт В. (2009). Биовизуализация: современные концепции световой и электронной микроскопии . Садбери, Массачусетс: Издательство Jones and Bartlett. п. 311. ИСБН  978-0-7637-3874-7 .
  10. ^ Jump up to: а б Бухвалов И.Б., Минин Е.А., Бекер В. (2005). «Метод многоцветного флуоресцентного иммуноокрашивания для одновременного нацеливания на антиген». Акта Гистохим . 107 (2): 143–8. дои : 10.1016/j.acthis.2005.01.003 . ПМИД   15950054 .
  11. ^ Рамос-Вара Х.А. (июль 2005 г.). «Технические аспекты иммуногистохимии». Ветеринар. Патол . 42 (4): 405–26. дои : 10.1354/vp.42-4-405 . ПМИД   16006601 . S2CID   6229029 .
  12. ^ Кумагай И, Цумото К (19 апреля 2010 г.). «Связывание антиген-антитело». Энциклопедия наук о жизни . стр. 1–7. дои : 10.1002/9780470015902.a0001117.pub2 . ISBN  978-0470016176 . {{cite book}}: |journal= игнорируется ( помогите )
  13. ^ Берри Р.В. (февраль 2000 г.). «Контроль специфичности иммуноцитохимических методов» . Дж. Гистохим. Цитохим . 48 (2): 163–6. дои : 10.1177/002215540004800201 . ПМИД   10639482 .
  14. ^ Бордо Дж., Уэлш А., Агарвал С., Киллиам Э., Бакеро М., Ханна Дж., Анагносту В., Римм Д. (март 2010 г.). «Валидация антител» . БиоТехники . 48 (3): 197–209. дои : 10.2144/000113382 . ПМК   3891910 . ПМИД   20359301 .
  15. ^ Мерфи, Дуглас Б. Дэвидсон; Майкл В. (2013). Основы световой микроскопии и электронной визуализации (второе изд.). Хобокен, Нью-Джерси: John Wiley and Sons, Inc., стр. 1–2. ISBN  978-0-471-69214-0 . {{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  16. ^ Фазекаш I, Хегедюс Б, Бачи Э и др. (2005). «Характеристика аденом гипофиза человека в клеточных культурах с помощью световой и электронной микроскопии, а также иммуномаркирования». Folia Histochemica et Cytobiologica . 43 (2): 81–90. ПМИД   16044945 .
  17. ^ Jump up to: а б с д Рассел, Джон Дж. Боззола; Лонни Д. (1999). Электронная микроскопия: принципы и методы для биологов (2-е издание) (2-е изд.). Садбери, Массачусетс [ua]: Джонс и Бартлетт. стр. 5 и 9. ISBN  978-0-7637-0192-5 . {{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  18. ^ Ким, Оливер (22 января 2009 г.). «Электронные микроскопы против оптических (световых) микроскопов» . Журнал Microbehunter по микроскопии . Проверено 4 мая 2013 г.
  19. ^ Джордж, Эндрю Джей Ти; Урч, Кэтрин Э. (2000). Диагностические и терапевтические антитела . Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. стр. 439–452. ISBN  9781592590766 .
  20. ^ Маэсима К., Ельцов М., Леммли Великобритания (ноябрь 2005 г.). «Структура хромосомы: улучшенная иммуномаркировка для электронной микроскопии» (PDF) . Хромосома . 114 (5): 365–75. дои : 10.1007/s00412-005-0023-7 . ПМИД   16175370 . S2CID   14768368 .
  21. ^ Люди С., Фрей Дж., Фавр Д., Стоффель М.Х. (апрель 2006 г.). «Оценка экспрессии энтеротоксигенных поверхностных антигенов, специфичных для Escherichia coli, в рекомбинантных штаммах методами трансмиссионной электронной микроскопии и иммуномечения» . Дж. Гистохим. Цитохим . 54 (4): 473–7. дои : 10.1369/jhc.5A6794.2005 . ПМИД   16344328 .
  22. ^ Гольдберг М.В. (2008). «Глава 7 Иммуномаркировка для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и автоэмиссионной СЭМ». Введение в электронную микроскопию для биологов . Методы клеточной биологии. Том. 88. стр. 109–30. дои : 10.1016/S0091-679X(08)00407-X . ISBN  9780123743206 . ПМИД   18617031 . {{cite book}}: |journal= игнорируется ( помогите )
  23. ^ Jump up to: а б с Россо Ф, Папале Ф, Барбариси А (2013). «Иммуномаркировка золотом в сканирующей электронной микроскопии окружающей среды в клеточной биологии». Методы визуализации клеток . Методы молекулярной биологии. Том. 931. стр. 517–23. дои : 10.1007/978-1-62703-056-4_27 . ISBN  978-1-62703-055-7 . ПМИД   23027021 .
  24. ^ Нарайанан Б.К., Коварик Л., Кинтана М.А., Миллс М.Дж. (2013). «Характеристика микроструктур ферритных сварных швов с использованием различных методов электронной микроскопии: обзор». Наука и технология сварки и соединения . 16 (1): 12–22. дои : 10.1179/136217110X12720264008312 . ISSN   1362-1718 . S2CID   135581795 .
  25. ^ Фолк В.П., Тейлор Г.М. (ноябрь 1971 г.). «Иммуноколлоидный метод для электронного микроскопа». Иммунохимия . 8 (11): 1081–3. дои : 10.1016/0019-2791(71)90496-4 . ПМИД   4110101 .
  26. ^ Оуэн Г.Р., Мередит Д.О., Ап Гвинн И., Ричардс Р.Г. (2001). «Усиление мест фокальной адгезии, меченных иммунозолотом, в фибробластах, культивируемых на металлических подложках: проблемы и решения». Клеточная Биол. Межд . 25 (12): 1251–9. дои : 10.1006/cbir.2001.0846 . ПМИД   11748918 . S2CID   21413153 .
  27. ^ Ван Дам, анемия; Алдерс, Морис К.Г.; де Пюи, Марсель; Горре, Шермейн М.; Ирмак, Дилбер; ван Леувен, Тон Г.; Ламбрехтс, Saskia AG (сентябрь 2014 г.). «Иммуномаркировка и совместимость с различными методами создания отпечатков пальцев» . Наука и справедливость . 54 (5): 356–362. doi : 10.1016/j.scijus.2014.06.005 . ПМИД   25278198 .
[ редактировать ]
Ресурсы библиотеки о
Иммуномаркировка
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Immunolabeling&oldid=1173750233"
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: 01e25f27b420fdf684edcf77f1948359__1693794840
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/01/59/01e25f27b420fdf684edcf77f1948359.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Immunolabeling - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)