Обмен кассет, опосредованный рекомбиназой

RMCE ( обмен кассет, опосредованный рекомбиназой ) — это процедура обратной генетики, позволяющая систематически и многократно модифицировать геномы высших эукариот путем целенаправленной интеграции, основанной на особенностях процессов сайт-специфической рекомбинации (SSR). Для RMCE это достигается путем чистой замены ранее существовавшей генной кассеты на аналогичную кассету, несущую «ген интереса» (GOI).

Генетическая модификация клеток млекопитающих — стандартная процедура производства правильно модифицированных белков, имеющих фармацевтическое значение. Чтобы добиться успеха, передача и экспрессия трансгена должны быть высокоэффективными и иметь в значительной степени предсказуемый результат. Современные разработки в области генной терапии основаны на тех же принципах. Традиционные процедуры, используемые для переноса ГОИ, недостаточно надежны, главным образом потому, что соответствующие эпигенетические влияния недостаточно изучены: трансгены интегрируются в хромосомы с низкой эффективностью и в локусах , которые обеспечивают лишь субоптимальные условия для их экспрессии . Как следствие, вновь введенная информация может не быть реализована (выражена), ген(ы) могут быть потеряны и/или повторно вставлены, и они могут привести клетки-мишени в нестабильное состояние. Именно в этот момент RMCE выходит на поле деятельности. Процедура была введена в 1994 году. ^[1] и он использует инструменты дрожжей и бактериофагов ^[2] эволюционировали для эффективной репликации важной генетической информации:

Общие принципы

Большинство штаммов дрожжей содержат кольцевые плазмидные ДНК, называемые «двухмикронными кругами». Персистенция этих объектов обеспечивается рекомбиназой, называемой «флиппаза» или «Flp» . Четыре мономера этого фермента связываются с двумя идентичными короткими (48 пар оснований) сайтами-мишенями, называемыми FRT («мишени флип-рекомбиназы»), что приводит к их кроссоверу . Результат такого процесса зависит от относительной ориентации участвующих FRT, что приводит к

инверсия . последовательности, фланкированной двумя идентичными, но обратно ориентированными FRT сайтами
удаление идентичными / разрешение последовательности, фланкированной двумя одинаково ориентированными FRT .
неэффективный возврат буквенного процесса, обычно называемый интеграцией или «добавлением» дополнительного участка ДНК, несущего один сайт FRT, идентичный целевому сайту

Этот спектр вариантов может быть значительно расширен за счет создания спейсерных мутантов для длиной 48 п.о. FRT расширенных сайтов (заштрихованные полустрелки на рисунке 1). Каждый мутантный Fn рекомбинирует с идентичным мутантным Fn с эффективностью, равной сайтам дикого типа (F x F). Перекрестное взаимодействие (F x Fn) строго предотвращается благодаря особой конструкции этих компонентов. Это создает основу для ситуации, изображенной на рисунке 1А:

кассета-мишень (здесь составной +/- маркер селекции) окружена сайтами F- и Fn. После его внедрения в геном клетки-хозяина характеризуются свойства многих сайтов интеграции (геномных «адресов») и выделяются соответствующие клоны.
GOI (ген интереса) является частью кольцевой «обменной плазмиды» и окружен набором совпадающих сайтов. Эту обменную плазмиду можно ввести в клетку при большом молекулярном избытке и, таким образом, она будет подвергаться описанной реакции обмена (RMCE-) с заранее выбранным геномным адресом (т.е. мишенью F<+/-> Fn).
этот принцип RMCE представляет собой процесс, который можно повторить с той же или другой обменной плазмидой («серийный RMCE»). Обратите внимание, что RMCE вводит только одну копию GOI в заранее определенный локус и что он не вводит совместно прокариотические векторные последовательности (пунктирные линии), которые в противном случае запускали бы иммунологические или эпигенетические защитные механизмы.

Впервые примененная для Tyr-рекомбиназы Flp, эта новая процедура не только актуальна для рационального конструирования биотехнологически значимых клеточных линий, но также находит все более широкое применение для систематического создания стволовых клеток . Стволовые клетки можно использовать для замены поврежденных тканей или для создания трансгенных животных с во многом заранее заданными свойствами.

Двойной RMCE

Ранее было установлено, что совместная экспрессия рекомбиназ Cre и Flp катализирует обмен последовательностями, фланкированными одиночными сайтами loxP и FRT, интегрированными в геном в случайном месте. Однако в этих исследованиях не изучалось, можно ли использовать такой подход для модификации условных аллелей мыши, несущих один или несколько сайтов loxP и FRT. двойной RMCE (dRMCE; Osterwalder et al., 2010) был недавно разработан как инструмент реинжиниринга, применимый к огромному количеству условных аллелей мышей, которые содержат сайты loxP и FRT дикого типа и, следовательно, несовместимы с обычным RMCE. Общая стратегия dRMCE использует тот факт, что большинство условных аллелей кодируют кассету селекции, фланкированную сайтами FRT, в дополнение к сайтам loxP, которые фланкируют функционально значимые экзоны («floxed» экзоны). Кассета селекции, окруженная FRT, обычно располагается за пределами области, окруженной loxP, что делает эти аллели непосредственно совместимыми с dRMCE. Одновременная экспрессия рекомбиназ Cre и Flp индуцирует цис-рекомбинацию и образование удаленного аллеля, который затем служит «сайтом стыковки», в который можно вставить замещающий вектор путем транс-рекомбинации. Правильно замененный локус будет кодировать пользовательскую модификацию и другую кассету выбора лекарства, фланкированную одиночными сайтами loxP и FRT. Таким образом, dRMCE представляется очень эффективным инструментом для целенаправленной реинжиниринга тысяч мышиных аллелей, созданных консорциумом IKMC.

Мультиплексирование RMCE

Установки мультиплексирования основаны на том факте, что каждая пара F-Fn (состоящая из сайта FRT дикого типа и мутанта, называемого «n») или каждая пара Fn-Fm (состоящая из двух мутантов, «m» и «n») представляет собой уникальный «адрес» в геноме. Обязательным условием являются различия в четырех из восьми положений проставки (см. рисунок 1Б). Если разница ниже этого порога, может произойти некоторое перекрестное взаимодействие между мутантами, приводящее к ошибочному удалению последовательности между гетероспецифичными (Fm/Fn или F/Fn) сайтами.

13 FRT-мутантов ^[3]^[4] Тем временем стали доступны, которые позволяют устанавливать несколько уникальных геномных адресов рядом (например, F-Fn и Fm-Fo). Эти адреса будут распознаваться донорскими плазмидами, которые были созданы в соответствии с теми же принципами, что допускает последовательные (но также синхронные) модификации в заранее определенных локусах . Эти модификации могут быть доведены до завершения в случае, если совместимая донорская плазмида(ы) предоставляется в избытке (принципы действия массы). Рисунок 2 иллюстрирует одно из применений принципа мультиплексирования: поэтапное расширение кодирующей области, в которой базовая единица экспрессии снабжена геномными изоляторами , энхансерами или другими цис -действующими элементами.

Недавний вариант общей концепции основан на PhiC31 (интегразе класса Ser) , который позволяет вводить другую мишень RMCE во вторичном сайте после того, как произошла первая модификация на основе RMCE. Это связано с тем, что каждый обмен, катализируемый phiC31, уничтожает сайты attP и attB, к которым он обратился. ^[2] преобразуя их в сайты продуктов att R и att L соответственно. Хотя эти изменения позволяют последующее монтирование новых (и, скорее всего, удаленных) мишеней, они не позволяют одновременно адресовать несколько мишеней RMCE и не допускают «последовательных RMCE», т.е. последовательных, поэтапных модификаций в данном геномном локусе.

Это отличается от Flp-RMCE, для которого статус FRT после RMCE соответствует их начальному состоянию. Это свойство делает возможным преднамеренную повторную мобилизацию целевой кассеты путем добавления новой донорской плазмиды с совместимой архитектурой. Эти опции «мультиплексирования-RMCE» открывают неограниченные возможности для последовательных и параллельных конкретных модификаций заранее определенных целей RMCE. ^[5]

Приложения

Создание трансгенных животных

Создание трансгенных нокаутных мышей и их генетическая модификация с помощью RMCE. ^[6]^[7]

Мечение и обмен кассет в клетках DG44 в суспензионной культуре

Вставка целевой кассеты в линию клеток-хозяев млекопитающих (CHO DG44 в суспензионной культуре) и обмен конструкцией репортера стресса ER посредством направленной интеграции (RMCE). ^[8]

См. также

Ссылки

^ Шлейк Т., Боде Дж. (1994). «Использование мутированных сайтов-мишеней распознавания Flp ( FRT- ) для обмена кассетами экспрессии в определенных хромосомных локусах ». Биохимия . 33 (43): 12746–12751. дои : 10.1021/bi00209a003 . ПМИД 7947678 . {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
^ Jump up to: ^а ^б Бейтман, Джек Р.; Энн М. Ли; Ц.-тин Ву (июнь 2006 г.). «Сайт-специфическая трансформация дрозофилы посредством обмена кассет, опосредованного phiC31-интегразой» . Генетика . 173 (2): 769–777. doi : 10.1534/genetics.106.056945 . ПМК 1526508 . ПМИД 16547094 .
^ Боде, Дж; Т. Шлейк; М. Ибер; Д. Шюбелер; Дж. Сейблер; Е. Снежков; Л. Николаев (2000). «Инструментарий трансгенетика - Новые методы целенаправленной модификации геномов эукариот». Биол. Хим . 381 (9–10): 801–813. дои : 10.1515/BC.2000.103 . ПМИД 11076013 .
^ Туран, С.; Кюле, Дж.; Шамбах, А.; Баум, К.; Боде, Дж. (2010). «Мультиплексирование RMCE: универсальные расширения технологии обмена кассет, опосредованной Flp-рекомбиназой». Дж. Мол. Биол . 402 (1): 52–69. дои : 10.1016/j.jmb.2010.07.015 . ПМИД 20650281 .
^ Туран, С; Дж. Боде (2011). «Сайт-специфические рекомбиназы: от геномных модификаций на основе тегов и мишеней» . ФАСЕБ Дж . 25 (12): 4088–4107. дои : 10.1096/fj.11-186940 . ПМИД 21891781 .
^ Чезари Ф., Реннекампф В., Винтерстен К., Вуонг Л.Г., Зайблер Дж., Боде Дж., Вибель Ф.Ф., Нордхайм А. (февраль 2004 г.). «Мыши с нокаутом Elk-1, созданные с помощью замены кассеты, опосредованной рекомбиназой Flp». Бытие . 38 (2): 87–92. дои : 10.1002/gen.20003 . ПМИД 14994271 .
^ Робрук А.Дж., Рикманс С., Лауэрс А., Фейертс Н., Смейерс Л., Хартманн Д. (январь 2006 г.). «Мутантные мыши с нокаутом Lrp1, полученные в результате рекомбиназно-опосредованного обмена кассет, обнаруживают различную важность мотивов NPXY во внутриклеточном домене LRP1 для нормального развития плода» . Мол Клеточная Биол . 26 (2): 605–16. дои : 10.1128/MCB.26.2.605-616.2006 . ПМЦ 1346909 . ПМИД 16382151 .
^ Кобер Л., Зехе С., Боде Дж. (октябрь 2012 г.). «Разработка новой системы селекции на основе стресса ER для выделения высокопродуктивных клонов». Биотехнология. Биоинж . 109 (10): 2599–611. дои : 10.1002/бит.24527 . ПМИД 22510960 .

Дж. Боде, С. Гетце, М. Клар, К. Маас, К. Нельсен, А. Умард и С. Винкельманн (2004) BIOForum 34-36 По модели вирусов: эффективная модификация клеток млекопитающих.
Чезари Ф., Реннекампф В., Винтерстен К., Вуонг Л.Г., Зайблер Дж., Боде Дж., Вибель Ф.Ф., Нордхайм А. (2004). «Мыши с нокаутом Elk-1, созданные с помощью замены кассеты, опосредованной рекомбиназой Flp». Бытие . 38 (2): 87–92. дои : 10.1002/gen.20003 . ПМИД 14994271 .
Робрук, AJM; Рикманс, С.; Лауэрс, А.; Фейертс, Н.; Смейерс, Л.; Хартманн, Д. (2006). «Мутантные мыши с нокаутом Lrp1, полученные с помощью RMCE, обнаруживают различную важность мотивов NPXY во внутриклеточном домене LRP1 для нормального развития плода» . Мол. Клетка. Биол . 26 (2): 605–616. дои : 10.1128/MCB.26.2.605-616.2006 . ПМЦ 1346909 . ПМИД 16382151 .
Бранда, CS; Дымецкий, С.М. (2004). «Говорим о революции: влияние сайт-специфических рекомбиназ на генетические анализы у мышей. Развивайтесь» . Развивающая клетка . 6 (1): 7–28. дои : 10.1016/S1534-5807(03)00399-X . ПМИД 14723844 .
Умар, А.; Цяо, Дж.; Йосток, Т.; Ли, Дж.; Боде, Дж. (2006). «Рекомендуемый метод использования хромосом: системы кассетного обмена на основе RMCE в биотехнологии клеток животных» . Цитотехнология . 50 (1–3): 93–108. дои : 10.1007/s10616-006-6550-0 . ПМК 3476001 . ПМИД 19003073 .
Цяо, Дж.; Умар, А.; Веглонер, В.; Боде, Дж. (2009). «Новые стратегии тегирования и обмена (RMCE) создают клоны мастер-клеток с предсказуемыми и стабильными свойствами экспрессии трансгена». Дж. Мол. Биол . 390 (4): 579–594. дои : 10.1016/j.jmb.2009.05.012 . hdl : 10033/76653 . ПМИД 19447116 .
Туран, Сорен; Галла, Мелани; Эрнст, Эллен; Цяо, Цзюньхуа; Фёлкель, Кристина; Шидльмайер, Бернхард; Зехе, Кристоф; Боде, Юрген (2011). «Обмен кассет, опосредованный рекомбиназой (RMCE): традиционные концепции и текущие проблемы». Журнал молекулярной биологии . 407 (2): 193–221. дои : 10.1016/j.jmb.2011.01.004 . ПМИД 21241707 .
Туран, С; Зехе, С; Кюле, Дж; Цяо, Дж; Боде, Дж (2013). «Обмен кассет, опосредованный рекомбиназой (RMCE) - быстро расширяющийся набор инструментов для целевых геномных модификаций». Джин . 515 (1): 1–27. дои : 10.1016/j.gene.2012.11.016 . ПМИД 23201421 .
Лаут, М.; Спреафико, Ф.; Детлеффсен, К.; Мейер, М (2002). «Стабильный и эффективный обмен кассет в невыбираемых условиях за счет комбинированного использования двух сайт-специфических рекомбиназ» . Нуклеиновые кислоты Рез . 30 (21): е115. дои : 10.1093/нар/gnf114 . ПМЦ 135837 . ПМИД 12409474 .
Остервальдер, Марко; Галли, Антонелла; Розен, Барри; Скарнес, Уильям С; Целлер, Рольф; Лопес-Риос, Хавьер (2010). «Двойной RMCE для эффективной реинжиниринга мутантных аллелей мышей» . Природные методы . 7 (11): 893–895. дои : 10.1038/nmeth.1521 . ПМЦ 3576631 . ПМИД 20953177 .

Внешние ссылки

https://www.sciencedaily.com/releases/2011/11/111130115822.htm

[1] Шлейк Т., Боде Дж. (1994). «Использование мутированных сайтов-мишеней распознавания Flp ( FRT- ) для обмена кассетами экспрессии в определенных хромосомных локусах ». Биохимия . 33 (43): 12746–12751. дои : 10.1021/bi00209a003 . ПМИД 7947678 . {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )

[phi-2] Jump up to: ^а ^б Бейтман, Джек Р.; Энн М. Ли; Ц.-тин Ву (июнь 2006 г.). «Сайт-специфическая трансформация дрозофилы посредством обмена кассет, опосредованного phiC31-интегразой» . Генетика . 173 (2): 769–777. doi : 10.1534/genetics.106.056945 . ПМК 1526508 . ПМИД 16547094 .

[3] Боде, Дж; Т. Шлейк; М. Ибер; Д. Шюбелер; Дж. Сейблер; Е. Снежков; Л. Николаев (2000). «Инструментарий трансгенетика - Новые методы целенаправленной модификации геномов эукариот». Биол. Хим . 381 (9–10): 801–813. дои : 10.1515/BC.2000.103 . ПМИД 11076013 .

[4] Туран, С.; Кюле, Дж.; Шамбах, А.; Баум, К.; Боде, Дж. (2010). «Мультиплексирование RMCE: универсальные расширения технологии обмена кассет, опосредованной Flp-рекомбиназой». Дж. Мол. Биол . 402 (1): 52–69. дои : 10.1016/j.jmb.2010.07.015 . ПМИД 20650281 .

[5] Туран, С; Дж. Боде (2011). «Сайт-специфические рекомбиназы: от геномных модификаций на основе тегов и мишеней» . ФАСЕБ Дж . 25 (12): 4088–4107. дои : 10.1096/fj.11-186940 . ПМИД 21891781 .

[pmid14994271-6] Чезари Ф., Реннекампф В., Винтерстен К., Вуонг Л.Г., Зайблер Дж., Боде Дж., Вибель Ф.Ф., Нордхайм А. (февраль 2004 г.). «Мыши с нокаутом Elk-1, созданные с помощью замены кассеты, опосредованной рекомбиназой Flp». Бытие . 38 (2): 87–92. дои : 10.1002/gen.20003 . ПМИД 14994271 .

[pmid16382151-7] Робрук А.Дж., Рикманс С., Лауэрс А., Фейертс Н., Смейерс Л., Хартманн Д. (январь 2006 г.). «Мутантные мыши с нокаутом Lrp1, полученные в результате рекомбиназно-опосредованного обмена кассет, обнаруживают различную важность мотивов NPXY во внутриклеточном домене LRP1 для нормального развития плода» . Мол Клеточная Биол . 26 (2): 605–16. дои : 10.1128/MCB.26.2.605-616.2006 . ПМЦ 1346909 . ПМИД 16382151 .

[pmid22510960-8] Кобер Л., Зехе С., Боде Дж. (октябрь 2012 г.). «Разработка новой системы селекции на основе стресса ER для выделения высокопродуктивных клонов». Биотехнология. Биоинж . 109 (10): 2599–611. дои : 10.1002/бит.24527 . ПМИД 22510960 .

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]