Быстрая амплификация концов кДНК
Быстрая амплификация концов кДНК ( RACE ) — это метод, используемый в молекулярной биологии для получения полной последовательности транскрипта РНК , обнаруженного внутри клетки. RACE приводит к образованию копии кДНК интересующей последовательности РНК, полученной посредством обратной транскрипции , с последующей ПЦР- амплификацией копий кДНК (см. ОТ-ПЦР ). Затем амплифицированные копии кДНК секвенируются и, если они достаточно длинные, должны сопоставляться с уникальной геномной областью. RACE обычно сопровождается клонированием перед секвенированием того, что изначально было отдельными молекулами РНК. Альтернативой с более высокой пропускной способностью, которая полезна для идентификации новых структур транскриптов, является секвенирование RACE-продуктов с помощью технологий секвенирования следующего поколения.
Процесс
[ редактировать ]RACE может обеспечить последовательность транскрипта РНК от небольшой известной последовательности внутри транскрипта до 5'-конца (5' RACE-PCR) или 3'-конца (3' RACE-PCR) РНК. Этот метод иногда называют односторонней ПЦР или закрепленной ПЦР .
Первым шагом в RACE является использование обратной транскрипции для создания копии кДНК участка транскрипта РНК. В этом процессе неизвестная концевая часть транскрипта копируется с использованием известной последовательности из центра транскрипта. Скопированная область ограничена известной последовательностью либо на 5'-, либо на 3'-конце.
Протоколы забегов на 5 и 3 минуты немного различаются. 5' RACE-PCR начинается с использования мРНК в качестве матрицы для первого раунда реакции синтеза кДНК (или обратной транскрипции ) с использованием антисмыслового (обратного) олигонуклеотидного праймера, который распознает известную последовательность в середине интересующего гена; праймер ( называется генспецифическим праймером GSP). Праймер связывается с мРНК, а фермент обратная транскриптаза добавляет пары оснований к 3'-концу праймера для создания специфического одноцепочечного продукта кДНК; это обратный комплемент мРНК. После синтеза кДНК фермент терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT) используется для добавления цепочки идентичных нуклеотидов , известной как гомополимерный хвост, к 3'-концу кДНК. (Есть и другие способы добавления 3'-концевой последовательности для первой цепи синтеза кДНК de novo, которые гораздо более эффективны, чем гомополимерный хвост, но смысл метода остается тем же). Затем проводят ПЦР , в которой используется второй антисмысловой ген-специфичный праймер (GSP2), который связывается с известной последовательностью, и смысловой (прямой) универсальный праймер (UP), который связывает гомополимерный хвост, добавленный к 3'-концам кДНК для амплификации продукта кДНК с 5'-конца.
3' RACE-PCR использует природный полиА-хвост , который существует на 3'-конце всех эукариотических мРНК для прайминга во время обратной транскрипции, поэтому этот метод не требует добавления нуклеотидов с помощью TdT. кДНК генерируются с использованием праймера Oligo-dT -адаптора (праймер с короткой последовательностью дезокси-тиминовых нуклеотидов), который дополняет участок полиА и добавляет специальную адаптерную последовательность к 5'-концу каждой кДНК. Затем используют ПЦР для амплификации 3'-кДНК из известной области с использованием смыслового GSP и антисмыслового праймера, комплементарного адаптерной последовательности.
RACE-секвенирование
[ редактировать ]Молекулы кДНК , полученные с помощью RACE, можно секвенировать с использованием технологий высокопроизводительного секвенирования (также называемых RACE-seq). Характеристика фрагментов RACE с помощью высокопроизводительного секвенирования занимает очень мало времени, более чувствительна, менее затратна и технически осуществима по сравнению с традиционной характеристикой фрагментов RACE с помощью молекулярного клонирования с последующим секвенированием нескольких клонов по Сэнгеру.
История и приложения
[ редактировать ]RACE можно использовать для амплификации неизвестных 5'-(5'-RACE) или 3'-(3'-RACE) частей молекул РНК, где часть последовательности РНК известна и на нее нацелен ген-специфичный праймер. В сочетании с высокопроизводительным секвенированием для характеристики этих амплифицированных продуктов RACE можно применить подход для характеристики любых типов кодирующих или некодирующих РНК-молекул.
Идея сочетания RACE с высокопроизводительным секвенированием была впервые представлена в 2009 году как Deep-RACE для картирования сайтов начала транскрипции (TSS) 17 генов в одной клеточной линии. [1] Например, в исследовании 2014 года по точному картированию сайтов расщепления РНК-мишени, управляемых синтетическими миРНК , этот подход сначала был назван RACE-seq. [2] Кроме того, методология была использована для характеристики полноразмерных неизвестных частей новых транскриптов и слитых транскриптов при колоректальном раке . [3] В другом исследовании, направленном на характеристику неизвестных структур транскриптов днРНК , RACE использовался в сочетании с полудлинным секвенированием 454 . [4]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Оливариус, С; Плесси, К; Карнинчи, П. (февраль 2009 г.). «Высокопроизводительная проверка стартовых сайтов транскрипции с помощью Deep-RACE» (PDF) . БиоТехники . 46 (2): 130–2. дои : 10.2144/000113066 . ПМИД 19317658 .
- ^ Дениз, Х; Мосхос, SA; Сиддерс, Б; Берден, Ф; Перкинс, Х; Картер, Н.; Страуд, Т; Кеннеди, М; Фэнси, ЮАР; Лапторн, К; Лаванда, H; Кинлох, Р; Сухи, Д; Корбау, Р. (4 февраля 2014 г.). «Информация о глубоком секвенировании терапевтической обработки shRNA и точности целевого расщепления siRNA» . Молекулярная терапия: нуклеиновые кислоты . 3 (2): е145. дои : 10.1038/mtna.2013.73 . ПМЦ 3951910 . ПМИД 24496437 .
- ^ Хофф, AM; Йоханнессен, Б; Алагаратнам, С; Чжао, С; Имя, Т; Лёвф, М; Баккен, AC; Гектоен, М; Свин, А; Лоте, РА; Скотхайм, Род-Айленд (3 ноября 2015 г.). «Новые варианты РНК при колоректальном раке» . Онкотаргет . 6 (34): 36587–602. дои : 10.18632/oncotarget.5500 . ПМЦ 4742197 . ПМИД 26474385 .
- ^ Лагард, Жюльен; Ущинска-Ратайчак, Барбара; Сантойо-Лопес, Хавьер; Гонсалес, Хосе Мануэль; Тапанари, Электра; Мадж, Джонатан М.; Стюард, Чарльз А.; Уилминг, Лоуренс; Танцер, Андреа; Ховальд, Седрик; Храст, Жаклин; Вела-Боза, Алисия; Руэда, Антонио; Лопес-Доминго, Франсиско Х.; Допазо, Хоакин; Реймонд, Александр; Гиго, Родерик; Харроу, Дженнифер (17 августа 2016 г.). «Расширение транскриптов lncRNA человека с помощью RACE в сочетании с высокопроизводительным секвенированием длительного чтения (RACE-Seq)» . Природные коммуникации . 7 : 12339. Бибкод : 2016NatCo...712339L . дои : 10.1038/ncomms12339 . ПМЦ 4992054 . ПМИД 27531712 .
- «Быстрая амплификация 5'-концов кДНК», в книге «Молекулярное клонирование: лабораторное руководство» (ред. Сэмбрук, Дж. и Рассел, Д.В.), глава 8, протокол 9, 8,54–8,60 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк). , США, 2001)
- Принципы манипуляции генами и геномики , С.Б. Примроуз и Р.М. Твайман, Blackwell Publishing, 2006 (7-е изд.), страницы 111–12.