Биоанализ микротокса
Microtox — это система тестирования in vitro , в которой используются биолюминесцентные бактерии ( Allivibrio fischeri , ранее известные как Vibrio fischeri ) для обнаружения токсичных веществ в различных субстратах, таких как вода, воздух, почва и отложения . [ 1 ] Allivibrio fischeri — это непатогенные морские бактерии , люминесценция которых является естественной частью их метаболизма . [ 2 ] При воздействии токсичного вещества дыхательный процесс бактерий нарушается, снижается светоотдача. [ 2 ] Allivibrio fischeri продемонстрировали высокую чувствительность к широкому спектру токсичных веществ. Реакция на токсичность наблюдается в виде изменения свечения, которое является побочным продуктом клеточного дыхания . [ 2 ] Это изменение можно использовать для расчета процентного ингибирования Allivibrio fischeri , которое напрямую коррелирует с токсичностью. [ 2 ]
Фон
[ редактировать ]Microtox был разработан Azur Environmental (ранее Microbics Corporation) в 1979 году как экономичная альтернатива тестам на токсичность, доступным в то время. [ 3 ] [ 4 ] До появления Microtox большинство тестов на токсичность воды, доступных для воды, были специально ориентированы на рыб и дафний. [ 3 ] [ 4 ] С момента своего создания Microtox стал стандартным методом тестирования токсичности воды, а также других субстратов, таких как почвы и отложения. [ 3 ] [ 5 ] [ 6 ]
В последние годы технология и название Microtox переходили в различные права собственности. В 2011 году Microtox и связанные с ним технологии были приобретены компанией Modern Water у компании Strategic Diagnostics Incorporated (SDIX) примерно за 4,5 миллиона долларов. [ 7 ] До SDIX Microtox принадлежала первоначальным разработчикам Azur Environmental. [ 3 ]
Microtox использует биолюминесцентные бактерии ( Allivibrio fischeri ) для определения токсичности конкретного вещества и/или субстрата. [ 3 ] [ 5 ] Во время клеточного метаболизма эти бактерии естественным образом излучают свет как часть клеточного дыхания , который можно измерить как люминесценцию. [ 3 ] При воздействии токсичных веществ можно наблюдать уменьшение люминесценции, а процентное изменение люминесценции может быть напрямую связано с токсичностью. [ 4 ] Были специально выбраны Allivibrio fischeri , поскольку эти бактерии можно было сохранить путем сублимационной сушки для увеличения срока хранения и использования. [ 3 ] как твердую фазу (почвы и отложения), так и водные испытания на острую токсичность (описанные ниже). С помощью этой технологии можно проводить [ 6 ]
Материалы
[ редактировать ]Анализаторы
[ редактировать ]Microtox Model 500 — это лабораторный фотометр , измеряющий острую токсичность . Этот анализатор представляет собой самокалибровающуюся биосенсорную измерительную систему с регулируемой температурой, которая использует биолюминесценцию Allivibrio fischeri для определения токсичности загрязненной воды или отходов загрязненных почв и отложений. [ 8 ]
Microtox Continuous Toxicity Monitor (CTM) — это анализатор Microtox для конкретного объекта, который непрерывно измеряет токсичность источника воды и мгновенно предоставляет результаты. Этот полностью автоматический анализатор имеет широкий диапазон обнаружения и может одновременно идентифицировать несколько тысяч загрязняющих веществ независимо от того, известен ли источник загрязнения или нет. Это устройство способно работать непрерывно до 4 недель и просто в эксплуатации и обслуживании. [ 9 ]
DeltaTox II — это портативный прибор, который можно использовать для проведения испытаний на острую токсичность и тестирование аденозинтрифосфата (АТФ). Это устройство, также известное как портативная версия Microtox Model 500, обеспечивает простое тестирование, использует образцы небольшого размера и представляет собой экономичный подход к анализу проб воды. Этот чувствительный и быстрый анализатор способен обнаруживать микробное загрязнение, а также более 2700 различных химических веществ. [ 10 ]
Реагент и растворы
[ редактировать ]Microtox Model 500 и Microtox FX
[ редактировать ]Срок годности острого реагента составляет два года, а растворов — три года при правильном хранении. [ 11 ]
Microtox Acute Reagent представляет собой лиофилизированную культуру Allivibrio fischeri , которую восстанавливают перед тестированием. Рекомендуется использовать реагент в течение трех часов после разведения. Чувствительность реагента может измениться по истечении рекомендованного периода времени. [ 11 ]
Раствор для регулирования осмотического регулирования Microtox (MOAS) — это нетоксичный раствор, состоящий из 22% хлорида натрия ( NaCl ) и сверхчистой воды. Этот раствор добавляют к образцу для доведения осмотического давления примерно до 2% NaCl . [ 11 ]
Восстановительный раствор состоит из специально подготовленной нетоксичной сверхчистой воды. [ 11 ]
Разбавитель представляет собой нетоксичный раствор, состоящий из 2% NaCl в сверхчистой воде. Этот раствор используется для разбавления образца и реагента , а также обеспечивает осмотическую защиту, необходимую для Allivibrio fischeri . [ 11 ] [ 12 ]
Методы
[ редактировать ]Подготовка образцов
[ редактировать ]Microtox может применяться к различным средам, включая питьевую воду , ливневые стоки , сточные воды , промышленные сбросы, почвы и отложения. [ 5 ] Большинство образцов не требуют специальной подготовки перед тестированием, за исключением доведения солености до 2%. [ 3 ] Однако образцы с определенными характеристиками, например, с высоким уровнем мутности , могут потребовать специальной подготовки. [ 3 ] проб требуется солености Если для снижения корректировка солености , это можно сделать путем добавления соответствующего количества осмотического корректирующего раствора Microtox для разбавления пробы. Например, добавление 0,1 мл МОАС к 1 мл образца приведет к разбавлению на 90,9% от исходной концентрации. [ 3 ] Если более высокая соленость требуется , это может быть достигнуто путем растворения твердого хлорида натрия в образце до достижения конечной солености 2% для защиты Allivibrio fischeri . [ 3 ] Сильно мутные образцы, содержащие твердые частицы, должны будут отстояться перед проведением теста. [ 3 ] Твердые частицы в образце могут мешать биолюминесценции, поглощая свет, и давать ошибочные результаты анализа. Интерференция люминесценции может также возникнуть в случае сильно окрашенных образцов (особенно красного, коричневого или черного). [ 3 ] Возможно, потребуется центрифугировать образцы для получения приемлемой прозрачности для анализа. [ 3 ] Если образцы содержат хлор , это может изменить токсичность для Allivibrio fischeri , а также привести к вводящим в заблуждение результатам. Образцы можно дехлорировать с использованием раствора тиосульфата натрия и деионизированной воды , что не влияет на результаты испытаний. [ 3 ] В идеале pH образцов не следует изменять, поскольку предпочтительно тестировать каждый образец при исходном уровне pH . Однако если необходимо отрегулировать pH, это следует сделать, добавив раствор гидроксида натрия или соляную кислоту . к образцу [ 3 ]
В отличие от проб воды, пробы почвы и отложений не являются однородными. [ 13 ] В результате из таких матриц сложно получить репрезентативные выборки. Токсичные вещества могут связываться с твердыми частицами, и степень связывания токсичных материалов зависит от состава частиц. Например, более мелкие частицы, такие как глина, имеют тенденцию прочно связываться с химическими веществами, действуя как ионообменные смолы . [ 12 ] [ 13 ] Тесты на микротоксичность осадка и почвы различаются по способу подготовки матрицы к контакту с Allivibrio fischeri . Чтобы получить репрезентативную пробу почвы или отложений, необходимо провести тест на элютриат. Элютриаты осадка можно получить путем экстракции дистиллированной водой, солевым раствором или органическим растворителем, таким как метиленхлорид или гексан . [ 12 ] Для проведения теста на элютриат образец почвы смешивают с экстрагентом в течение определенного периода времени, затем дают отстояться и отбирают образец из экстракта. Если в собранной пробе присутствуют твердые частицы, возможно, потребуется центрифугировать пробу для достижения оптимальной прозрачности. Кроме того, поровую воду отложений можно собрать центрифугированием и протестировать без экстракции. [ 12 ]
Процедуры
[ редактировать ]Существует пять основных тестов на микротоксичность, включая базовый тест, 100% тест, твердофазный тест, сравнительный тест и тест на ингибирование. Из этих пяти тестов три используются для тестирования отложений и почвы, включая базовый тест, 100% тест и твердофазный тест. [ 12 ] Все эти версии основаны на одном и том же общем методе восстановления Allivibrio fischeri реагента в растворе для восстановления. Вносятся поправки на соленость и твердые частицы, затем бактерии подвергаются воздействию раствора образца в зависимости от методов конкретного теста. Светоотдачу бактерий измеряют с помощью фотометра через пять и 15 минут после воздействия бактерий на образцы. [ 12 ] Измеряемый свет напрямую коррелирует с токсичностью образца, предоставляя данные, которые позволяют рассчитать EC50 или IC50 или другие значения ECxx и ICxx. [ 14 ]
Базовый тест на острую токсичность — это процедура, позволяющая измерить относительную острую токсичность образца. Этот тест является лучшим протоколом для тестирования образцов с неизвестной токсичностью, высоким уровнем токсичности или когда результаты теста должны обеспечивать максимальную достоверность и точность. Этот тест состоит из двух контролей и восьми разведений образцов в двух экземплярах. [ 14 ]
100% тест на острую токсичность — это процедура, которая проверяет образец при 100% концентрации образца и в результате включает добавление раствора реагента непосредственно в образец. [ 15 ] Этот тест используется для образцов, которые, как ожидается, будут иметь низкий уровень токсичности, и обычно используется в качестве инструмента экологического скрининга. По сравнению с базовым тестом он более чувствителен к технике работы оператора и, как следствие, может быть менее точным. [ 12 ]
Твердофазный тест на острую токсичность — это процедура, которая позволяет тестируемому организму вступить в прямой контакт с твердым образцом в виде частиц в водной суспензии. Обычно этот тест дает результаты, указывающие на равную или более высокую токсичность по сравнению с тестами на элюат или поровую воду того же образца. [ 16 ] Это связано либо с равной, либо с повышенной биодоступностью в результате прямого контакта. Этот тест подвержен воздействию нескольких источников помех люминесценции, включая гибель бактерий из-за эффектов, отличных от токсичности, таких как фильтрация образца; поглощение света за счет цвета; и рассеяние света из-за мутности . [ 16 ] Исправления можно внести путем тестирования образца частиц аналогичного состава, который, как известно, не является токсичным. Этот тест состоит из двух контролей и 13 разведений образцов в двух экземплярах. [ 16 ] Твердофазный тест подвергает бактерии воздействию таким образом, что не всегда возможно при использовании поровой воды и элютриата. [ 12 ]
Тесты сравнения и ингибирования острой токсичности являются лучшими процедурами для тестирования образцов с низким уровнем токсичности, когда ECxx не может быть определен с помощью базового теста. [ 17 ] Эти протоколы рекомендуются для тестирования сточных вод очистных сооружений , ливневых стоков , питьевой воды , поровой воды и элюата. [ 17 ] В этих тестах используются несколько повторов образца при одной концентрации. Подобно базовому тесту, протокол сравнительного теста использует показания освещенности с нулевым временем, используемые для корректировки показаний уровня освещенности, рассчитанных по времени. Процедура теста на ингибирование не использует показания освещенности с нулевым временем и, следовательно, не может использовать поправочный коэффициент для показаний уровня освещенности по времени. Оба этих теста состоят из пяти контролей и пяти повторов образца с одной концентрацией. [ 17 ]
Программное обеспечение Microtox Omni
[ редактировать ]Программное обеспечение Microtox Omni было разработано Azur Environmental и позволяет пользователям анализатора Microtox Model 500 проводить тесты, визуализировать данные, рассчитывать статистику и создавать отчеты. [ 18 ] Эта программа содержит набор шаблонов для всех часто используемых тестов на токсичность и позволяет изменять или добавлять предоставленные шаблоны. Модификация этих шаблонов позволяет создавать новые форматы тестов, изначально не включенные в программное обеспечение. [ 18 ] Шаблоны испытаний, включенные в это программное обеспечение, определяют все параметры для конкретного метода испытаний. Эта программа рассчитывает наиболее эффективный способ настройки желаемого теста на анализаторе модели 500. В состав Microsoft Omni также включен наставник по тестированию, который дает перечисленные инструкции по настройке и запуску интересующего теста. [ 18 ] Это программное обеспечение позволяет пользователям загружать файлы из предыдущих версий программного обеспечения Microtox DOS, а также дает пользователям возможность сохранять новые данные в этом исходном формате. В это программное обеспечение включена база данных , которая предоставляет пользователям доступ к данным ряда других пользователей и испытательных площадок, что позволяет сравнивать данные и тенденции изменений с течением времени. Microtox Omni можно использовать с любым количеством баз данных . [ 18 ]
Приложение
[ редактировать ]Microtox имеет множество экологических и промышленных применений. Обычно их применяют для тестирования токсичности как морской, так и пресноводной воды, а также отложений на наличие пестицидов и других неорганических и органических химикатов. [ нужна ссылка ]
Питьевая вода: Microtox используется для проверки источников питьевой воды во многих районах, где возможно случайное или преднамеренное загрязнение. На наличие токсичных примесей в питьевой воде указывает изменение цвета или интенсивности света или изменение скорости использования кислорода. [ 8 ]
Озера и реки: Микротокс используется для проверки токсичности озерных и речных отложений, загрязненных металлами или неспецифическими загрязнителями. Твердофазный тест используется для отложений, а базовый тест или 100%-ный тест используется для поровой воды. [ 12 ]
Тестирование отложений: Microtox используется для тестирования и оценки токсичности различных морских и пресноводных отложений, загрязненных металлами и органикой. Водные экстракты загрязненных почв, буровых растворов и шламов. Данные о микротоксичности могут использоваться для установления порога видимого воздействия (AET), стандартов качества отложений и использования для разрешений NPDES , а также уровней очистки Superfund . [ 12 ]
Промышленность: этот биоанализ используется для оценки токсичности сложных источников промышленных сточных вод. Это экономически эффективный способ мониторинга и тестирования большого количества образцов. Microtox также может применяться в качестве системы раннего предупреждения (EWS) и помогать в обнаружении присутствия токсичных материалов, а также прогнозировать результаты других биологических анализов и тестов. [ 19 ]
Микротокс также применялся при испытаниях на животных в качестве альтернативы in vitro . [ нужна ссылка ]
Экологическая значимость
[ редактировать ]Многочисленные исследования и опубликованные данные, сравнивающие результаты Microtox со значениями токсичности для рыб, ракообразных и водорослей, обнаружили положительную корреляцию. [ 20 ] Однако другие отметили, что влияние яркости на выживание организмов неизвестно. Также были высказаны опасения по поводу использования экстрактов отложений, а не самих отложений. Вполне возможно, что будут проверяться только водорастворимые загрязняющие вещества, и поэтому они не будут репрезентативными для всего спектра загрязняющих веществ, присутствующих в осадке. Экстракты также могут удалять загрязнения, которые не являются биодоступными. Это может привести к завышенной или заниженной оценке загрязняющих веществ и их биологических эффектов. [ 12 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ «Заявление о совместной проверке ETV» Программа проверки экологических технологий Агентства по охране окружающей среды. Агентство по охране окружающей среды. Проверено 22 мая 2014 г.
- ^ Jump up to: а б с д «Microtox 500: ведущие в отрасли испытания на токсичность» , дата обращения: 28 мая 2014 г.
- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я дж к л м н тот п «Руководство Microtox SOLO», дата обращения 23 мая 2014 г.
- ^ Jump up to: а б с Маркинг Л.Л., Кимерле Р.А. (1979). «Использование люминесцентных батарей для определения токсичности в водных средах». Американское общество по испытаниям и материалам: ASTM STP 667:98-106 [1]
- ^ Jump up to: а б с «Микротокс для анализа осадка». SDIX. 2010. Проверено 23 мая 2014 г. Архивировано 2 июня 2014 г. в Wayback Machine.
- ^ Jump up to: а б «Как использовать тест на острую токсичность Microtox для выполнения
Внутренняя оценка снижения токсичности (TRE)» SDIX. 2006 Проверено 23 мая 2014 г. «Архивная копия» (PDF) . Архивировано из оригинала (PDF) 2 июня 2014 г. Проверено 1 июня 2014 г.
{{cite web}}: CS1 maint: архивная копия в заголовке ( ссылка ) - ^ «СОВРЕМЕННАЯ ВОДА ПРИОБРЕТАЕТ БИЗНЕС SDIX WATER QUALITY, ВКЛЮЧАЯ МИКРОТОКС» Современная вода. 2011. Проверено 23 мая 2014 г. [2]
- ^ Jump up to: а б «Информационный бюллетень Modern Water Microtox M500» , Modern Water. ND Проверено 28 мая 2014 г.
- ^ «Информационный бюллетень Modern Water Microtox CTM». Архивировано 4 марта 2016 г. в Wayback Machine , Modern Water. ND Проверено 28 мая 2014 г.
- ^ «Информационный бюллетень о современной воде DeltaTox II» , «Современная вода». ND Проверено 28 мая 2014 г.
- ^ Jump up to: а б с д и «Обзор острой токсичности современного водного микротокса». Архивировано 16 мая 2017 г. в Wayback Machine , Modern Water. ND Проверено 28 мая 2014 г.
- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я дж к «Обзор и оценка теста на микротоксичность пресноводных отложений», Департамент экологии штата Вашингтон. Ноябрь 1992 г. Проверено 28 мая 2014 г.
- ^ Jump up to: а б «Твердофазное испытание (SPT)». Архивировано 2 июня 2014 г. в Wayback Machine Azur Environmental. 1998. Проверено 28 мая 2014 г.
- ^ Jump up to: а б Основные процедуры испытаний на острую токсичность Microtox Azur Environmental. 1995. Проверено 28 мая 2014 г.
- ^ 100% тест на острую токсичность Microtox. Азур Экологический. 1995. Проверено 28 мая 2014 г.
- ^ Jump up to: а б с Твердофазный тест Microtox на острую токсичность. Азур Экологический. 1995. Проверено 28 мая 2014 г.
- ^ Jump up to: а б с Сравнение острой токсичности Microtox и тест на ингибирование. Азур Экологический. 1995. Проверено 28 мая 2014 г.
- ^ Jump up to: а б с д «Программное обеспечение Azur Environmental MicrotoxOmni для Windows 95/98/NT» Azur Environmental. 1999. Проверено 28 мая 2014 г.
- ^ Куреши А.А., Булич А.А., Изенберг Д.Л. 1998. «Системы тестирования токсичности Microtox – где они находятся сегодня». Микромасштабные испытания в водной токсикологии: достижения, методы и практика. Глава 13: 185–195. Проверено 28 мая 2014 г. [3]
- ^ «Испытание на токсичность микротокса». Архивировано 19 августа 2006 г. в Wayback Machine Leeder Consulting. ND Проверено 28 мая 2014 г.