Кап-анализ экспрессии генов

Cap-анализ экспрессии генов ( CAGE ) — это метод экспрессии генов , используемый в молекулярной биологии для создания снимка 5'-конца популяции информационной РНК в биологическом образце ( транскриптоме ). Небольшие фрагменты (исторически длиной 27 нуклеотидов , но теперь ограниченные только технологиями секвенирования) из самых начал мРНК (5'-концы кэпированных транскриптов) извлекаются, обратно транскрибируются в кДНК, амплифицируются с помощью ПЦР (при необходимости) и секвенируются . CAGE была впервые опубликована Хаяшизаки, Карнинчи и их коллегами в 2003 году. ^{[ 1 ]} CAGE широко использовался в исследовательских проектах FANTOM .

Анализ

Выходные данные CAGE представляют собой набор коротких нуклеотидных последовательностей (часто называемых тегами по аналогии с тегами экспрессируемых последовательностей ) с их наблюдаемым количеством. Число копий тегов CAGE обеспечивает цифровую количественную оценку содержания транскриптов РНК в биологических образцах. Используя эталонный геном, исследователь обычно может с некоторой уверенностью определить исходную мРНК (и, следовательно, из какого гена ) была извлечена метка.

В отличие от аналогичного метода последовательного анализа экспрессии генов (SAGE), в котором метки происходят из других частей транскриптов, CAGE в первую очередь используется для определения точных сайтов начала транскрипции в геноме. Эти знания, в свою очередь, позволяют исследователю исследовать структуру промотора , необходимую для экспрессии генов.

Теги CAGE, как правило, начинаются с дополнительного гуанина (G), который не кодируется в геноме, что связано с 5'-удлинением без шаблона во время первой цепи кДНК. синтеза ^{[ 2 ]} или обратная транскрипция самого кэпа. ^{[ 3 ]} Если это не исправить, это может привести к ошибочному сопоставлению тегов CAGE, например, с нетранскрибируемыми псевдогенами. ^{[ 2 ]} С другой стороны, это добавление G также использовалось в качестве сигнала для фильтрации более надежных пиков TSS. ^{[ 4 ]}

История

Оригинальный метод CAGE (Шираки и др. , 2003) ^{[ 1 ]} использовал CAP Trapper ^{[ 5 ]} для захвата 5'-концов, олиго-dT-праймеры для синтеза кДНК, фермент рестрикции типа IIs MmeI для расщепления меток и метод Сэнгера для их секвенирования.

Случайные праймеры обратной транскрипции были представлены в 2006 году Kodzius et al. ^{[ 6 ]} для лучшего обнаружения неполиаденилированных РНК.

В DeepCAGE (Вален и др. , 2008) ^{[ 7 ]} Конкатемеры меток секвенировали с более высокой производительностью на » 454 платформе секвенирования « следующего поколения .

В 2008 году к протоколу DeepCAGE было добавлено мультиплексирование штрих-кодов (Maeda et al. , 2008). ^{[ 8 ]}

В nanoCAGE (Плесси и др. , 2010) ^{[ 9 ]} 5'-концы или РНК захватывали с помощью метода переключения матрицы вместо CAP Trapper, чтобы анализировать меньшие стартовые количества общей РНК. Более длинные метки были расщеплены ферментом рестрикции типа III EcoP15I и секвенированы напрямую на платформе Solexa (тогда Illumina) без конкатенации.

Методология CAGEscan (Plessy et al. , 2010), ^{[ 9 ]} где ферментативное расщепление метки пропущено и 5'-кДНК, секвенированные по парным концам , были представлены в той же статье для соединения новых промоторов с известными аннотациями.

С помощью HeliScopeCAGE (Канамори-Катаяма и др. , 2011 г.) ^{[ 10 ]} протокол CAGE с ловушкой CAP был изменен, чтобы пропустить ферментативное расщепление метки и секвенировать непосредственно закрытые 5'-концы на платформе HeliScope , без ПЦР-амплификации. Затем это было автоматизировано Ито и др. ^{[ 11 ]} в 2012 году.

В 2012 году стандартный протокол CAGE был обновлен Takahashi et al. ^{[ 12 ]} расщеплять метки с помощью EcoP15I и секвенировать их на платформе Illumina-Solexa.

В 2013 году Батут и др. ^{[ 13 ]} комбинированный CAP-ловец, переключение матрицы и расщепление 5'-фосфат-зависимой экзонуклеазой в RAMPAGE для максимизации специфичности промотора.

В 2014 году Мурата и др. ^{[ 14 ]} опубликовали протокол nAnTi-CAGE , в котором кэпированные 5'-концы секвенируются на платформе Illumina без ПЦР-амплификации и без расщепления метки.

В 2017 году Пулен и др. ^{[ 15 ]} обновил протокол nanoCAGE , чтобы использовать метод тегментации (основанный на транспозиции Tn5 ) для мультиплексирования.

В 2018 году Цветешич и др. ^{[ 16 ]} увеличил чувствительность CAGE, захваченного CAP, путем введения селективно разлагаемой РНК-носителя (SLIC-CAGE, «Super-Low Input Carrier-CAGE»).

В 2021 году Такахаши и др. ^{[ 17 ]} упростил секвенирование библиотек CAGE на секвенаторах Illumina, пропустив синтез второй цепи, напрямую загружая одноцепочечные кДНК (Low Quantity Single Strand CAGE, «LQ-ssCAGE»).

См. также

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^б Шираки, Т; Кондо, С; Катаяма, С; и др. (23 декабря 2003 г.). «Экспрессия генов Cap-анализа для высокопроизводительного анализа начальной точки транскрипции и идентификации использования промотора» . Proc Natl Acad Sci США . 100 (26): 15776–81. Бибкод : 2003PNAS..10015776S . дои : 10.1073/pnas.2136655100 . ПМК 307644 . ПМИД 14663149 .
^ Jump up to: ^а ^б Чжао, Сяобэй (2011). «Систематическая кластеризация ландшафтов сайтов начала транскрипции» . ПЛОС ОДИН . 6 (8): e23409. Бибкод : 2011PLoSO...623409Z . дои : 10.1371/journal.pone.0023409 . ПМК 3160847 . ПМИД 21887249 .
^ Отаке, Хидеки; Окото, Куниео; Исимару, Ёсихиро; Като, Сейши (2004). «Определение последовательности кэпированного сайта мРНК на основе обнаружения кэп-зависимого добавления нуклеотидов с использованием метода якорного лигирования» . ДНК Рез . 11 (4): 305–9. дои : 10.1093/dnares/11.4.305 . ПМИД 15500255 .
^ Камби, Джейсон (2015). «NanoCAGE-XL и CapFilter: подход к полногеномной идентификации сайтов начала транскрипции с высокой достоверностью» . БМК Геномика . 16 (1): 597. doi : 10.1186/s12864-015-1670-6 . ПМК 4534009 . ПМИД 26268438 .
^ Карнинчи, Пьеро (1996). «Высокоэффективное клонирование полноразмерной кДНК с помощью биотинилированного ловушки CAP». Геномика . 37 (3): 327–36. дои : 10.1006/geno.1996.0567 . ПМИД 8938445 .
^ Кодзиус, Римантас (2006). «CAGE: анализ экспрессии генов». Нат-методы . 3 (3): 211–22. дои : 10.1038/nmeth0306-211 . ПМИД 16489339 . S2CID 32641130 .
^ Вален, Эйвинд (2009). «Полногеномное обнаружение и анализ основных промоторов гиппокампа с использованием DeepCAGE» . Геном Рез . 19 (2): 255–265. дои : 10.1101/гр.084541.108 . ПМЦ 2652207 . ПМИД 19074369 .
^ Маэда, Норихиро (2008). «Разработка метода маркировки штрих-кода ДНК для мониторинга динамических изменений экспрессии генов с использованием сверхвысокопроизводительного секвенатора» . БиоТехники . 45 (1): 95–7. дои : 10.2144/000112814 . ПМИД 18611171 . Проверено 28 апреля 2016 г.
^ Jump up to: ^а ^б Плесси, Чарльз (2010). «Связывание промоторов с функциональными транскриптами в небольших образцах с помощью nanoCAGE и CAGEscan» . Нат-методы . 7 (7): 528–34. дои : 10.1038/nmeth.1470 . ПМК 2906222 . ПМИД 20543846 .
^ Канамори-Катаяма, Охотник (2011). «Неамплифицированный кэп-анализ экспрессии генов на секвенаторе одной молекулы» . Геном Рез . 21 (7): 1150–9. дои : 10.1101/гр.115469.110 . ПМК 3129257 . ПМИД 21596820 .
^ Ито, Масаеши (2012). «Автоматизированный рабочий процесс подготовки кДНК для кэп-анализа экспрессии генов на секвенаторе одной молекулы» . ПЛОС ОДИН . 7 (1): e30809. Бибкод : 2012PLoSO...730809I . дои : 10.1371/journal.pone.0030809 . ПМЦ 3268765 . ПМИД 22303458 .
^ Такахаси, Хадзуки (2012). «Профилирование 5'-концевой экспрессии с использованием экспрессии генов кэп-анализа и секвенирования следующего поколения» . Нат Проток . 7 (3): 542–61. дои : 10.1038/нпрот.2012.005 . ПМЦ 4094379 . ПМИД 22362160 .
^ Батют, Филипп (2013). «Высокоточное профилирование промоторов показывает широко распространенное использование альтернативных промоторов и управляемую транспозонами экспрессию генов развития» . Геном Рез . 23 (1): 169–80. дои : 10.1101/гр.139618.112 . ПМК 3530677 . ПМИД 22936248 .
^ Мурата, Мицуёси (2014). «Обнаружение экспрессируемых генов с помощью CAGE». Сети регуляции транскрипционных факторов . Методы молекулярной биологии. Том. 1164. стр. 67–85. дои : 10.1007/978-1-4939-0805-9_7 . ISBN 978-1-4939-0804-2 . ПМИД 24927836 .
^ Пулен, Стефан (2017). «NanoCAGE: метод анализа кодирующих и некодирующих 5'-концевых транскриптомов». Связанная с промотором РНК . Методы молекулярной биологии. Том. 1543. стр. 57–109. дои : 10.1007/978-1-4939-6716-2_4 . ISBN 978-1-4939-6714-8 . ПМИД 28349422 .
^ Цветешич, Невена (2018). «SLIC-CAGE: картирование сайта начала транскрипции с высоким разрешением с использованием нанограммовых уровней тотальной РНК» . Геномные исследования . 28 (12): 1943–1956. дои : 10.1101/гр.235937.118 . ПМК 6280763 . ПМИД 30404778 .
^ Такахаси, Хадзуки (2021). «Малоколичественные одноцепочечные CAGE (LQ-ssCAGE) картируют регуляторные усилители и промоторы». Усилители и промоторы . Методы Мол Биол. Том. 2351. стр. 67–90. дои : 10.1007/978-1-0716-1597-3_4 . ISBN 978-1-0716-1596-6 . ПМИД 34382184 . S2CID 243553132 .

Внешние ссылки

Домашняя страница CAGE в Научном центре RIKEN Omics.
Страница протоколов на сайте FANTOM5.

[Shiraki-2003-1] Jump up to: ^а ^б Шираки, Т; Кондо, С; Катаяма, С; и др. (23 декабря 2003 г.). «Экспрессия генов Cap-анализа для высокопроизводительного анализа начальной точки транскрипции и идентификации использования промотора» . Proc Natl Acad Sci США . 100 (26): 15776–81. Бибкод : 2003PNAS..10015776S . дои : 10.1073/pnas.2136655100 . ПМК 307644 . ПМИД 14663149 .

[Zhao2011-2] Jump up to: ^а ^б Чжао, Сяобэй (2011). «Систематическая кластеризация ландшафтов сайтов начала транскрипции» . ПЛОС ОДИН . 6 (8): e23409. Бибкод : 2011PLoSO...623409Z . дои : 10.1371/journal.pone.0023409 . ПМК 3160847 . ПМИД 21887249 .

[Ohtake2004-3] Отаке, Хидеки; Окото, Куниео; Исимару, Ёсихиро; Като, Сейши (2004). «Определение последовательности кэпированного сайта мРНК на основе обнаружения кэп-зависимого добавления нуклеотидов с использованием метода якорного лигирования» . ДНК Рез . 11 (4): 305–9. дои : 10.1093/dnares/11.4.305 . ПМИД 15500255 .

[Cumbie-2015-4] Камби, Джейсон (2015). «NanoCAGE-XL и CapFilter: подход к полногеномной идентификации сайтов начала транскрипции с высокой достоверностью» . БМК Геномика . 16 (1): 597. doi : 10.1186/s12864-015-1670-6 . ПМК 4534009 . ПМИД 26268438 .

[Carninci-1996-5] Карнинчи, Пьеро (1996). «Высокоэффективное клонирование полноразмерной кДНК с помощью биотинилированного ловушки CAP». Геномика . 37 (3): 327–36. дои : 10.1006/geno.1996.0567 . ПМИД 8938445 .

[Kodzius-2006-6] Кодзиус, Римантас (2006). «CAGE: анализ экспрессии генов». Нат-методы . 3 (3): 211–22. дои : 10.1038/nmeth0306-211 . ПМИД 16489339 . S2CID 32641130 .

[Valen-2009-7] Вален, Эйвинд (2009). «Полногеномное обнаружение и анализ основных промоторов гиппокампа с использованием DeepCAGE» . Геном Рез . 19 (2): 255–265. дои : 10.1101/гр.084541.108 . ПМЦ 2652207 . ПМИД 19074369 .

[Maeda-2008-8] Маэда, Норихиро (2008). «Разработка метода маркировки штрих-кода ДНК для мониторинга динамических изменений экспрессии генов с использованием сверхвысокопроизводительного секвенатора» . БиоТехники . 45 (1): 95–7. дои : 10.2144/000112814 . ПМИД 18611171 . Проверено 28 апреля 2016 г.

[Plessy-2010-9] Jump up to: ^а ^б Плесси, Чарльз (2010). «Связывание промоторов с функциональными транскриптами в небольших образцах с помощью nanoCAGE и CAGEscan» . Нат-методы . 7 (7): 528–34. дои : 10.1038/nmeth.1470 . ПМК 2906222 . ПМИД 20543846 .

[Kanamori-Katayama-2011-10] Канамори-Катаяма, Охотник (2011). «Неамплифицированный кэп-анализ экспрессии генов на секвенаторе одной молекулы» . Геном Рез . 21 (7): 1150–9. дои : 10.1101/гр.115469.110 . ПМК 3129257 . ПМИД 21596820 .

[Itoh-2012-11] Ито, Масаеши (2012). «Автоматизированный рабочий процесс подготовки кДНК для кэп-анализа экспрессии генов на секвенаторе одной молекулы» . ПЛОС ОДИН . 7 (1): e30809. Бибкод : 2012PLoSO...730809I . дои : 10.1371/journal.pone.0030809 . ПМЦ 3268765 . ПМИД 22303458 .

[Takahashi-2012-12] Такахаси, Хадзуки (2012). «Профилирование 5'-концевой экспрессии с использованием экспрессии генов кэп-анализа и секвенирования следующего поколения» . Нат Проток . 7 (3): 542–61. дои : 10.1038/нпрот.2012.005 . ПМЦ 4094379 . ПМИД 22362160 .

[Batut-2013-13] Батют, Филипп (2013). «Высокоточное профилирование промоторов показывает широко распространенное использование альтернативных промоторов и управляемую транспозонами экспрессию генов развития» . Геном Рез . 23 (1): 169–80. дои : 10.1101/гр.139618.112 . ПМК 3530677 . ПМИД 22936248 .

[Murata-2014-14] Мурата, Мицуёси (2014). «Обнаружение экспрессируемых генов с помощью CAGE». Сети регуляции транскрипционных факторов . Методы молекулярной биологии. Том. 1164. стр. 67–85. дои : 10.1007/978-1-4939-0805-9_7 . ISBN 978-1-4939-0804-2 . ПМИД 24927836 .

[Poulain-2017-15] Пулен, Стефан (2017). «NanoCAGE: метод анализа кодирующих и некодирующих 5'-концевых транскриптомов». Связанная с промотором РНК . Методы молекулярной биологии. Том. 1543. стр. 57–109. дои : 10.1007/978-1-4939-6716-2_4 . ISBN 978-1-4939-6714-8 . ПМИД 28349422 .

[Cvetesic-2018-16] Цветешич, Невена (2018). «SLIC-CAGE: картирование сайта начала транскрипции с высоким разрешением с использованием нанограммовых уровней тотальной РНК» . Геномные исследования . 28 (12): 1943–1956. дои : 10.1101/гр.235937.118 . ПМК 6280763 . ПМИД 30404778 .

[Takahashi-2021-17] Такахаси, Хадзуки (2021). «Малоколичественные одноцепочечные CAGE (LQ-ssCAGE) картируют регуляторные усилители и промоторы». Усилители и промоторы . Методы Мол Биол. Том. 2351. стр. 67–90. дои : 10.1007/978-1-0716-1597-3_4 . ISBN 978-1-0716-1596-6 . ПМИД 34382184 . S2CID 243553132 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]

[ 15 ]

[ 16 ]

[ 17 ]