Анализ связывания селекции и амплификации

Анализ связывания селекции и амплификации (SAAB) — это метод молекулярной биологии, обычно используемый для поиска ДНК сайта связывания с белками . ^{[ 1 ]} Он был разработан Т. Китом Блэквеллом и Гарольдом М. Вайнтраубом в 1990 году.

Метод

Экспериментальная процедура SAAB состоит из нескольких этапов, в зависимости от имеющихся знаний о сайте связывания. Типичный SAAB состоит из следующих этапов:

Синтез матрицы со случайной последовательностью в сайте связывания: возможны три ситуации: (i) когда и сайт связывания, и белок известны и доступны; (ii) когда доступен только консенсусный сайт связывания, а связывающий белок отсутствует; и (iii) когда белок доступен, но сайт связывания неизвестен. Если сайт связывания неизвестен, количество случайных положений нуклеотидов в матрице должно быть большим.
Инкубируйте меченую двухцепочечную матрицу с белком: обычно белок необходимо синтезировать в клетке-хозяине с помощью методов слияния. Более длительное время инкубации и большое количество обеспечиваются в случае неспецифического сайта связывания. ^{[ 2 ]}
Изолируйте связанный с ДНК белок с помощью EMSA: связанный с ДНК белок, мигрировавший в акриламидном геле, выделяют авторадиографией в соответствии с протоколом анализа сдвига электрофоретической подвижности (EMSA). ^{[ 3 ]}
Усиливайте связанный шаблон с помощью ПЦР. Для положительного контроля также усилите исходный шаблон; Связанную ДНК выделяют путем вырезания из геля, очищают и амплифицируют с помощью ПЦР.
Пометьте усиленный сайт связывания и повторно выберите для связывания с помощью EMSA. Предшествуйте этапу связывания не менее 5 раз с амплифицированным меченым образцом ДНК и слитым белком.
Секвенирование ДНК . После заключительного этапа отбора и электрофореза клонируйте ДНК в клонирующий вектор и секвенируйте его. Первоначально Блэквелл использовал пиросеквенирование, которое можно заменить современными методами. ^{[ 4 ]}

Приложения

Quox гомеодомен

Quox1 представляет собой гомеобоксный ген, участвующий в регуляции закономерностей развития ( морфогенеза ) у животных, грибов и растений, и первоначально был выделен из библиотеки кДНК пятинедельного эмбриона перепела . Это единственный ген в семействе hox, который, как было обнаружено, экспрессируется как в переднем, так и в среднем мозге, участвуя в дифференцировке центральных и периферических нервных клеток. Оптимальный сайт связывания ДНК для Quox1 или его гомологов млекопитающих был идентифицирован SAAB в 2004 году. ^{[ 5 ]} Амплифицированный фрагмент ДНК Quox1, полученный в результате ПЦР-амплификации из библиотеки кДНК эмбриона человека, расщепляли EcoRV и XhoI и клонировали в сайты рестрикции SmaI и XhoI вектора экспрессии pGEMEXxBal. Рекомбинантные плазмиды трансформировали в компетентный штамм Escherichia coli BL21, и слитые белки Quox1 выделяли хроматографическими методами.

Радиомеченый зонд инкубировали с 25 пмоль очищенного слитого белка гомеодомена Quox1 в связывающем буфере для EMSA. Связанную с белком ДНК выявляли авторадиографией, полосы, представляющие комплексы белок-ДНК, вырезали из геля, а элюированную ДНК амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров, комплементарных неслучайным фланкирующим последовательностям длиной 20 п.н. После пяти повторений одной и той же процедуры очищенную ДНК клонировали в pMD 18T и секвенировали. Наконец, последовательность КААТК была идентифицирована как консенсусная связывающая последовательность для гомеодомена Quox1.

Скрининг

Сочетая возможности выбора случайной последовательности с объединенным секвенированием, анализ импринта SAAB делает возможным одновременный скрининг большого количества мутантов сайта связывания. ^{[ 6 ]} SAAB также позволяет идентифицировать сайты с высокой относительной аффинностью связывания, поскольку конкуренция заложена в протоколе. Он также может идентифицировать нейтральные положения сайтов или специфические основания, которые могут мешать связыванию, например Т в -4 в полусайте E47. ^{[ 7 ]} Мы также можем применить эту технику к последовательностям связывания с меньшим сродством, при условии, что на каждом этапе связывания будет поддерживаться высокая концентрация связывающего белка. Также возможно идентифицировать сайт связывания, даже если ни белок, ни его последовательность неизвестны. ^{[ 1 ]}

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^б Блэквелл Т.К., Вайнтрауб Х. (1990). «Различия и сходства в предпочтениях связывания ДНК белковых комплексов MyoD и E2A, выявленные путем выбора сайта связывания». Наука . 250 (4984): 1104–10. Бибкод : 1990Sci...250.1104B . дои : 10.1126/science.2174572 . ПМИД 2174572 .
^ Амендт Б.А., Сазерленд Л.Б., Руссо А.Ф. (1999). «Транскрипционный антагонизм между Hmx1 и Nkx2.5 по общему сайту связывания ДНК» . Журнал биологической химии . 274 (17): 11635–42. дои : 10.1074/jbc.274.17.11635 . ПМИД 10206974 .
^ Риенхофф HY (1989). «Идентификация усилителя транскрипции в гене амилоида мыши» (PDF) . Журнал биологической химии . 264 (1): 419–25. дои : 10.1016/S0021-9258(17)31274-7 . ПМИД 2909529 .
^ Ким Т.Г., Краус Дж.К., Чен Дж., Ли Ю. (2003). «ДЗЮМОНДЖИ, критический фактор сердечного развития, действует как репрессор транскрипции» . Журнал биологической химии . 278 (43): 42247–55. дои : 10.1074/jbc.M307386200 . ПМИД 12890668 .
^ источник не получен [6]
^ источник не получен [7]
^ источник не получен [8]

Дальнейшее чтение

Амендт Б.А., Сазерленд Л.Б., Руссо А.Ф. (1999). «Многофункциональная роль С-концевого хвоста гомеодоменного белка Pitx2» . Молекулярная и клеточная биология . 19 (10): 7001–10. дои : 10.1128/MCB.19.10.7001 . ПМК 84695 . ПМИД 10490637 .

[Blackwell_1990-1] Jump up to: ^а ^б Блэквелл Т.К., Вайнтрауб Х. (1990). «Различия и сходства в предпочтениях связывания ДНК белковых комплексов MyoD и E2A, выявленные путем выбора сайта связывания». Наука . 250 (4984): 1104–10. Бибкод : 1990Sci...250.1104B . дои : 10.1126/science.2174572 . ПМИД 2174572 .

[Amendt_1999-2] Амендт Б.А., Сазерленд Л.Б., Руссо А.Ф. (1999). «Транскрипционный антагонизм между Hmx1 и Nkx2.5 по общему сайту связывания ДНК» . Журнал биологической химии . 274 (17): 11635–42. дои : 10.1074/jbc.274.17.11635 . ПМИД 10206974 .

[Rienhoff_1989-3] Риенхофф HY (1989). «Идентификация усилителя транскрипции в гене амилоида мыши» (PDF) . Журнал биологической химии . 264 (1): 419–25. дои : 10.1016/S0021-9258(17)31274-7 . ПМИД 2909529 .

[Kim_2003-4] Ким Т.Г., Краус Дж.К., Чен Дж., Ли Ю. (2003). «ДЗЮМОНДЖИ, критический фактор сердечного развития, действует как репрессор транскрипции» . Журнал биологической химии . 278 (43): 42247–55. дои : 10.1074/jbc.M307386200 . ПМИД 12890668 .

[5] источник не получен [6]

[6] источник не получен [7]

[7] источник не получен [8]

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]