Ледзим

Вторичная структура последовательности лидзима, полученная с использованием mfold. Он состоит из асимметричной внутренней петли, состоящей из шести нуклеотидов. Стрелка указывает место расщепления.

На рисунке показаны мультяшные изображения основной и прекаталитической конформаций свинцового фермента. Зеленые сферы представляют собой Mg. ²⁺ ионы, а красные сферы представляют собой ионы Sr2+. Рисунок визуализирован в pymol с использованием координат из файла PDB 1NUV.

Ледзим — небольшой рибозим (каталитическая РНК), катализирующий расщепление специфической фосфодиэфирной связи . Это было обнаружено в ходе исследования эволюции in vitro, в ходе которого исследователи отбирали РНК, которые специфически расщеплялись в присутствии свинца . Однако с тех пор он был обнаружен в нескольких природных системах. Leadzyme оказался эффективным и динамичным в присутствии микромолярных концентраций ионов свинца . В отличие от других небольших саморасщепляющихся рибозимов , ионы других двухвалентных металлов не могут заменить Pb. ²⁺ в лидзиме. В связи с обязательной потребностью в свинце рибозим называют металлорибозимом.

Ледзим подвергся обширному биохимическому и структурному исследованию. Минимальная вторичная структура свинцового фермента на удивление очень проста. Он состоит из асимметричной внутренней петли, состоящей из шести нуклеотидов и спиральной области на каждой стороне внутренней петли. Сайт расщепления лидзима расположен внутри асимметричной внутренней петли длиной четыре нуклеотида, которая также состоит из спиралей РНК с обеих сторон. Это показано на верхнем рисунке справа, который представляет собой вторичную структуру свинцового фермента, созданную с помощью mfold. Структуры лидзима также были решены с помощью рентгеновской кристаллографии и ЯМР. Кристаллические структуры двух конформаций свинцового фермента показаны на нижнем рисунке справа.

Каталитический механизм лидзима

Считается, что Leadzyme осуществляет катализ с использованием двухэтапного механизма. На первой стадии реакции фосфодиэфирная связь расщепляется на два продукта: 5'-продукт, оканчивающийся 2'3'-циклическим фосфатом, и 3'-продукт, оканчивающийся 5'-гидроксилом. Этот этап аналогичен другим небольшим саморасщепляющимся рибозимам, таким как рибозим Hammerhead и рибозим HDV . Оба этих рибозима образуют продукт, содержащий 2',3'-циклический фосфат. Однако в лидзиме этот продукт является всего лишь промежуточным продуктом. На втором этапе этого пути реакции 2'-3'-циклический фосфат подвергается гидролизу с образованием 3'-монофосфата. Этот способ катализа похож на то, как функционируют рибонуклеазы (белки), а не на любой известный небольшой саморасщепляющийся рибозим.

Считается, что свинцовый фермент имеет очень динамичную структуру. Многие исследования, включая ЯМР , рентгеновскую кристаллографию и молекулярное моделирование, выявили несколько разные структуры. Недавно с помощью спектроскопии с временным разрешением было показано, что активный центр свинцового фермента очень динамичен. Он отбирает множество различных конформаций в растворе, и дельта G взаимного превращения между различными конформациями очень мала. В соответствии с этими исследованиями кристаллическая структура с высоким разрешением также выявила две различные конформации свинцового фермента с разными сайтами связывания Mg. ²⁺ и старший ²⁺ (Пб ²⁺ заменители) в двух конформациях. В основном состоянии свинцовый фермент связывает один Sr ²⁺ ион у нуклеотидов G43, G45 и A45. Этот сайт связывания находится вдали от разрезаемой связи (сайта расщепления) и, таким образом, не объясняет участие Pb ²⁺ в катализе. Однако во второй конформации, называемой «прекаталитическим» состоянием, рибозим демонстрирует два Sr ²⁺ сайты связывания. G43 и G42 взаимодействуют с одним Sr ²⁺ тогда как второй Sr ²⁺ взаимодействует с A45, C23 и G24. Этот второй сэр ²⁺ Сайт связывания также потенциально взаимодействует с 2'-ОН C23 через молекулу воды. Этот второй сайт связывания объясняет, как Pb ²⁺ может облегчить катализ, отрывая протон 2-OH и подготавливая его к прямой нуклеофильной атаке на разрезаемый фосфат. Это также подтверждается тем фактом, что реакция свинцового фермента зависит от pH. Таким образом, Pb ²⁺ может действовать как кислота Льюиса и активировать 2-ОН в C23. Кристаллическая структура соответствует двухметаллическому ионному механизму, который был предложен для катализа свинцовым ферментом.

Токсичность свинца через свинцовый фермент

Токсичные металлы, такие как свинец, представляют опасность для окружающей среды и здоровья и при воздействии могут проникать в биологические системы. Свинец является стойким металлом и может со временем накапливаться в организме человека из-за его частого использования в промышленности и присутствия в окружающей среде. Вдыхание свинца может иметь последствия, варьирующиеся от едва заметных симптомов до серьезных заболеваний. Вполне возможно, что присутствие свинца в наших биологических системах может вызвать катализ ионами свинца. Поскольку свинцовый фермент представляет собой относительно простой мотив существует множество последовательностей , т.е. он имеет простую складку, оказывается, что в геномах многих природных систем , которые потенциально могут сворачиваться в структуру свинцового фермента. Простой поиск этого мотива РНК в геномах человека, Drosophila melanogaster , Caenorhabditis elegans и Arabidopsis thaliana показал, что в среднем этот мотив присутствует с частотой 2-9 мотивов на 1 Мб последовательности ДНК. Они также показали, что мотив лидзима очень часто встречается в последовательностях мРНК этих организмов. Таким образом, эти последовательности потенциально могут саморасщепляться в присутствии ионов свинца. Нацеливание свинца на эти мотивы РНК в мРНК и других РНК может объяснить опосредованную свинцом токсичность, приводящую к гибели клеток.

Дальнейшее чтение

• Пан, Т.; Уленбек, О.К. (1992). «Маленький металлорибозим с двухэтапным механизмом». Природа . 358 (6387): 560–563. Бибкод : 1992Natur.358..560P . дои : 10.1038/358560a0 . ПМИД   1501711 . S2CID   4361511 .
• Пан, Т.; Уленбек, О.К. (1992). «Отбор РНК in vitro, подвергающихся аутолитическому расщеплению свинцом (2+)». Биохимия . 31 (16): 3887–3895. дои : 10.1021/bi00131a001 . ПМИД   1373649 .
• Барчишевская, МЗ; Вышко, Э.; Лысый, Р.; Эрдманн, Вирджиния; Барцишевски, Дж. (2003). «5S рРНК представляет собой свинцовый фермент. Молекулярная основа токсичности свинца». Журнал биохимии . 133 (3): 309–315. дои : 10.1093/jb/mvg042 . ПМИД   12761166 .
• Киковская, Е.; Миккельсен, Н.-Э.; Кирсебом, Луизиана (2005). «Естественно транс-действующая рибозимная РНКаза P РНК обладает свойствами свиндзима» . Исследования нуклеиновых кислот . 33 (21): 6920–6930. дои : 10.1093/nar/gki993 . ПМК   1310964 . ПМИД   16332695 .
• Барчишевская, МЗ; и др. (2005). «Токсичность свинца через свинцовый фермент». Исследования мутаций/обзоры исследований мутаций . 589 (2): 103–110. дои : 10.1016/j.mrrev.2004.11.002 . ПМИД   15795164 .
• Ведекинд, Дж. Э.; Маккей, Д.Б. (1999). «Кристаллическая структура свинцово-зависимого рибозима, обнаруживающая сайты связывания металлов, имеющие отношение к катализу». Структурная биология природы . 6 (3): 261–268. дои : 10.1038/6700 . ПМИД   10074945 . S2CID   23837 .
• Хугстратен, КГ; Лего, П.; Парди, А. (1998). «Структура раствора ЯМР свинцово-зависимого рибозима: свидетельства динамики катализа РНК». Журнал молекулярной биологии . 284 (2): 337–350. дои : 10.1006/jmbi.1998.2182 . ПМИД   9813122 .
• Ведекинд, Дж. Э.; Маккей, Д.Б. (2003). «Кристаллическая структура свинцового фермента при разрешении 1,8 Å: связывание ионов металла и значение для каталитического механизма и регуляции ионов алло-сайта †». Биохимия . 42 (32): 9554–9563. дои : 10.1021/bi0300783 . ПМИД   12911297 .
• Ферре-Д'Амаре, Арканзас; Скотт, WG (2010). «Малые саморасщепляющиеся рибозимы» . Перспективы Колд-Спринг-Харбор в биологии . 2 (10): а003574. doi : 10.1101/cshperspect.a003574 . ПМЦ   2944367 . ПМИД   20843979 .
• Кадаккужа, Б.М.; Чжао, Л.; Ся, Т. (2009). «Конформационное распределение и сверхбыстрая базовая динамика лидзима». Биохимия . 48 (18): 3807–3809. дои : 10.1021/bi900256q . ПМИД   19301929 .
• Омичи, Т.; Сугимото, Н. (1997). «Роль Nd3+ и Pb2+ в реакции расщепления РНК малым рибозимом †». Биохимия . 36 (12): 3514–3521. дои : 10.1021/bi962030d . ПМИД   9132001 .