Флоксинг

В генной инженерии флоксинг относится к вставке последовательности ДНК (которая затем называется флоксированной ) между двумя последовательностями LoxP , создавая искусственную кассету генов , которую затем можно условно удалить (выбить), транслоцировать или инвертировать в процессе. называется рекомбинацией Cre-Lox . ^[1] Рекомбинация между сайтами LoxP катализируется рекомбиназой Cre . Термин «флоксинг» представляет собой комбинацию, образованную от фразы «фланговый/ фланкированный LoxP».

Метод флоксинга имеет важное значение при разработке научных модельных систем, поскольку он позволяет исследователям иметь пространственные и временные изменения экспрессии генов. ^[2] Система Cre-Lox широко используется для управления экспрессией генов в модельных организмах, таких как мыши, с целью изучения заболеваний человека и разработки лекарств. ^[3] Например, используя систему Cre-Lox, исследователи могут изучать онкогены и гены- супрессоры опухолей , а также их роль в развитии и прогрессировании рака на моделях мышей. ^[4]

Использование в исследованиях

Флоксирование гена позволяет его удалить (нокаутировать), ^[5]^[6] транслоцирован или вставлен ^[7] (посредством различных механизмов рекомбинации Cre-Lox).

Флоксинг генов имеет важное значение для разработки научных модельных систем, поскольку он позволяет изменять пространственную и временную экспрессию генов. С точки зрения непрофессионала, ген может быть нокаутирован (инактивирован) в определенной ткани in vivo в определенное время, выбранное ученым. Затем учёный сможет оценить влияние нокаутированного гена и определить его нормальную функцию. ^[8] Это отличается от отсутствия гена с момента зачатия, при котором инактивация или потеря генов, необходимых для развития организма, может мешать нормальному функционированию клеток и препятствовать производству жизнеспособного потомства. ^[9]

Механизм удаления

События делеции полезны для проведения экспериментов по редактированию генов путем точного удаления сегментов или даже целых генов. Удаление требует флоксирования интересующего сегмента с сайтами loxP, обращенными в том же направлении. Рекомбиназа Cre обнаружит однонаправленные сайты loxP и вырезает фрагментированный сегмент ДНК. ^[10] Успешно отредактированные клоны можно выбрать с помощью маркера выбора, который можно удалить с помощью той же системы Cre-LoxP. ^[10] Тот же механизм можно использовать для создания условных аллелей путем введения сайта FRT/Flp , который реализует тот же механизм, но с другим ферментом.

Механизм инверсии

События инверсии полезны для инактивации гена или последовательности ДНК без фактического их удаления и, таким образом, для поддержания постоянного количества генетического материала. Инвертированные гены не часто связаны с аномальными фенотипами , а это означает, что инвертированные гены обычно жизнеспособны. ^[11] Для рекомбинации Cre-LoxP, приводящей к инверсии, требуются сайты loxP, фланкирующие интересующий ген, причем сайты loxP ориентированы друг к другу как инвертированные повторы . Подвергаясь рекомбинации Cre, область, фланкированная сайтами loxP, станет инвертированной, т.е. повторно вставленной в то же положение, но в обратной ориентации; ^[12] этот процесс не является постоянным и может быть обращен вспять. ^[13]

Механизм транслокации

События транслокации происходят, когда сайты loxP фланкируют гены на двух разных молекулах ДНК в однонаправленной ориентации. Затем рекомбиназа Cre используется для создания транслокации между двумя молекулами ДНК, обменивая генетический материал с одной молекулы ДНК на другую, образуя одновременную транслокацию обоих флоксированных генов. ^[12]^[14]

Общие применения в исследованиях

Было показано, что кардиомиоциты (ткань сердечной мышцы) экспрессируют тип рекомбиназы Cre, который очень специфичен для кардиомиоцитов и может использоваться исследователями для выполнения высокоэффективных рекомбинаций. Это достигается за счет использования типа Cre, выражение которого определяется $\alpha$ -промотор тяжелой цепи миозина ( $\alpha$ -МойХК) . Эти рекомбинации способны разрушать гены способом, специфичным для сердечной ткани in vivo , и позволяют создавать условные нокауты сердца, в основном для использования в качестве контроля. ^[15] Например, используя рекомбиназу Cre с $\alpha$ - Промотор MyHC вызывает инактивацию гена floxed только в сердце. Кроме того, эти нокауты можно сделать индуцируемыми. В нескольких исследованиях на мышах тамоксифен использовался для индукции экспрессии рекомбиназы Cre . ^[2] В этом случае рекомбиназа Cre слита с частью мышиного рецептора эстрогена (ER), которая содержит мутацию в лиганд-связывающем домене (LBD) . Мутация делает рецептор неактивным, что приводит к неправильной локализации за счет его взаимодействия с белками-шаперонами, такими как белки теплового шока 70 и 90 ( Hsp70 и Hsp90 ). Тамоксифен связывается с Cre-ER и нарушает его взаимодействие с шаперонами, что позволяет слитому белку Cre-ER проникнуть в ядро и выполнить рекомбинацию на флоксированном гене. ^[16]^[17] Кроме того, рекомбиназа Cre может индуцироваться под действием тепла, когда она находится под контролем специфических элементов теплового шока (HSE). ^[18]^[19]

Ссылки

^ Надь А. (февраль 2000 г.). «Cre-рекомбиназа: универсальный реагент для адаптации генома» . Бытие . 26 (2): 99–109. doi : 10.1002/(SICI)1526-968X(200002)26:2<99::AID-GENE1>3.0.CO;2-B . ПМИД 10686599 . S2CID 2916710 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Хаяши С., МакМахон AP (апрель 2002 г.). «Эффективная рекомбинация в различных тканях с помощью индуцируемой тамоксифеном формы Cre: инструмент для регулируемой во времени активации/инактивации генов у мышей» . Биология развития . 244 (2): 305–18. дои : 10.1006/dbio.2002.0597 . ПМИД 11944939 .
^ Генетика мышей: методы и протоколы . Сингх, Шри Рам, Коппола, Винченцо. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк. 26 июля 2014 г. ISBN 9781493912155 . OCLC 885338722 . {{cite book}}: CS1 maint: отсутствует местоположение издателя ( ссылка ) CS1 maint: другие ( ссылка )
^ Грин Дж. Э., Рид Т. (2012). Генетически модифицированные мыши для исследования рака . дои : 10.1007/978-0-387-69805-2 . ISBN 978-0-387-69803-8 . S2CID 40599715 .
^ Фридель Р.Х., Вурст В., Веферс Б., Кюн Р. (2011). «Создание мышей с условным нокаутом». Методы и протоколы для трансгенных мышей . Методы молекулярной биологии. Том. 693. стр. 205–31. дои : 10.1007/978-1-60761-974-1_12 . ISBN 978-1-60761-973-4 . ПМИД 21080282 .
^ Сакамото К., Гурумурти CB, Вагнер К.У. (2014), Сингх С.Р., Коппола В. (ред.), «Поколение мышей с условным нокаутом», Генетика мышей , Методы молекулярной биологии, том. 1194, Springer New York, стр. 21–35, номер документа : 10.1007/978-1-4939-1215-5_2 , ISBN. 9781493912148 , PMID 25064096
^ Имута Ю., Кийонари Х., Чан К.В., Берингер Р.Р., Сасаки Х. (март 2013 г.). «Поколение мышей с нокаутом, которые экспрессируют усиленный ядерным зеленым флуоресцентным белком и индуцируемую тамоксифеном рекомбиназу Cre в хорде из локусов Foxa2 и T» . Бытие . 51 (3): 210–8. дои : 10.1002/dvg.22376 . ПМЦ 3632256 . ПМИД 23359409 .
^ Зал B, Лимайе А, Кулкарни AB (сентябрь 2009 г.). «Обзор: поколение мышей с нокаутом генов» . Современные протоколы клеточной биологии . Глава 19: Раздел 19.12 19.12.1–17. дои : 10.1002/0471143030.cb1912s44 . ПМЦ 2782548 . ПМИД 19731224 .
^ Родригес Й.В., Шахнович Е.И. (01.08.2019). «Адаптация к мутационной инактивации важного гена E. coli сходится к доступному субоптимальному пику приспособленности» . bioRxiv : 552240. arXiv : 1902.06630 . дои : 10.1101/552240 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Швенк Ф., Барон У., Раевский К. (декабрь 1995 г.). «Кре-трансгенный штамм мышей для повсеместной делеции сегментов гена, окруженных loxP, включая делецию в зародышевых клетках» . Исследования нуклеиновых кислот . 23 (24): 5080–1. дои : 10.1093/нар/23.24.5080 . ПМК 307516 . ПМИД 8559668 .
^ Гриффитс А.Дж., Миллер Дж.Х., Сузуки Д.Т., Левонтин Р.К., Гелбарт В.М. (2000). «Инверсии» . Введение в генетический анализ. 7-е издание .
^ Перейти обратно: ^а ^б Сюй Дж, Чжу Ю (август 2018 г.). «Быстрый метод in vitro для переворачивания двойной перевернутой открытой рамки считывания в плазмиде» . БМК Биотехнология . 18 (1): 52. дои : 10.1186/s12896-018-0462-x . ПМК 6119287 . ПМИД 30170595 .
^ Обердерфер П., Отипоби К.Л., Маруяма М., Раевски К. (ноябрь 2003 г.). «Однонаправленная Cre-опосредованная генетическая инверсия у мышей с использованием мутантной пары loxP lox66/lox71» . Исследования нуклеиновых кислот . 31 (22): 140д–140. дои : 10.1093/нар/gng140 . ПМЦ 275577 . ПМИД 14602933 .
^ Гриффитс А.Дж., Миллер Дж.Х., Сузуки Д.Т., Левонтин Р.К., Гелбарт В.М. (2000). «Транслокации». Введение в генетический анализ (7-е изд.).
^ Пугач Е.К., Ричмонд, Пенсильвания, Азофейфа Дж.Г., Доуэлл Р.Д., Лейнванд Л.А. (сентябрь 2015 г.). «Продолжительная экспрессия Cre, управляемая промотором тяжелой цепи α-миозина, может быть кардиотоксичной» . Журнал молекулярной и клеточной кардиологии . 86 : 54–61. дои : 10.1016/j.yjmcc.2015.06.019 . ПМЦ 4558343 . ПМИД 26141530 .
^ Даниелян П.С., Муччино Д., Рович Д.Х., Майкл С.К., МакМахон А.П. (декабрь 1998 г.). «Модификация активности генов у эмбрионов мышей внутриутробно с помощью тамоксифен-индуцируемой формы рекомбиназы Cre» . Современная биология . 8 (24): 1323–6. Бибкод : 1998CBio....8.1323D . дои : 10.1016/s0960-9822(07)00562-3 . ПМИД 9843687 .
^ Методы трансгенеза: принципы и протоколы . Кларк, Алан Р. (2-е изд.). Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. 2002. ISBN 9781592591787 . OCLC 50175106 . {{cite book}}: CS1 maint: другие ( ссылка )
^ Рак и рыбки данио: механизмы, методы и модели . Лангенау, Дэвид М. Швейцария. 10 мая 2016 г. ISBN 9783319306544 . OCLC 949668674 . {{cite book}}: CS1 maint: отсутствует местоположение издателя ( ссылка ) CS1 maint: другие ( ссылка )
^ Кобаяши К., Камей Ю., Киносита М., Черни Т., Танака М. (январь 2013 г.). «Индуцируемая нагреванием система индукции гена CRE/LOXP в Медаке». Бытие . 51 (1): 59–67. дои : 10.1002/dvg.22348 . ПМИД 23019184 . S2CID 25211137 .

[1] Надь А. (февраль 2000 г.). «Cre-рекомбиназа: универсальный реагент для адаптации генома» . Бытие . 26 (2): 99–109. doi : 10.1002/(SICI)1526-968X(200002)26:2<99::AID-GENE1>3.0.CO;2-B . ПМИД 10686599 . S2CID 2916710 .

[HayashiMcMahon20022-2] Перейти обратно: ^а ^б Хаяши С., МакМахон AP (апрель 2002 г.). «Эффективная рекомбинация в различных тканях с помощью индуцируемой тамоксифеном формы Cre: инструмент для регулируемой во времени активации/инактивации генов у мышей» . Биология развития . 244 (2): 305–18. дои : 10.1006/dbio.2002.0597 . ПМИД 11944939 .

[:4-3] Генетика мышей: методы и протоколы . Сингх, Шри Рам, Коппола, Винченцо. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк. 26 июля 2014 г. ISBN 9781493912155 . OCLC 885338722 . {{cite book}}: CS1 maint: отсутствует местоположение издателя ( ссылка ) CS1 maint: другие ( ссылка )

[:3-4] Грин Дж. Э., Рид Т. (2012). Генетически модифицированные мыши для исследования рака . дои : 10.1007/978-0-387-69805-2 . ISBN 978-0-387-69803-8 . S2CID 40599715 .

[5] Фридель Р.Х., Вурст В., Веферс Б., Кюн Р. (2011). «Создание мышей с условным нокаутом». Методы и протоколы для трансгенных мышей . Методы молекулярной биологии. Том. 693. стр. 205–31. дои : 10.1007/978-1-60761-974-1_12 . ISBN 978-1-60761-973-4 . ПМИД 21080282 .

[6] Сакамото К., Гурумурти CB, Вагнер К.У. (2014), Сингх С.Р., Коппола В. (ред.), «Поколение мышей с условным нокаутом», Генетика мышей , Методы молекулярной биологии, том. 1194, Springer New York, стр. 21–35, номер документа : 10.1007/978-1-4939-1215-5_2 , ISBN. 9781493912148 , PMID 25064096

[:1-7] Имута Ю., Кийонари Х., Чан К.В., Берингер Р.Р., Сасаки Х. (март 2013 г.). «Поколение мышей с нокаутом, которые экспрессируют усиленный ядерным зеленым флуоресцентным белком и индуцируемую тамоксифеном рекомбиназу Cre в хорде из локусов Foxa2 и T» . Бытие . 51 (3): 210–8. дои : 10.1002/dvg.22376 . ПМЦ 3632256 . ПМИД 23359409 .

[8] Зал B, Лимайе А, Кулкарни AB (сентябрь 2009 г.). «Обзор: поколение мышей с нокаутом генов» . Современные протоколы клеточной биологии . Глава 19: Раздел 19.12 19.12.1–17. дои : 10.1002/0471143030.cb1912s44 . ПМЦ 2782548 . ПМИД 19731224 .

[9] Родригес Й.В., Шахнович Е.И. (01.08.2019). «Адаптация к мутационной инактивации важного гена E. coli сходится к доступному субоптимальному пику приспособленности» . bioRxiv : 552240. arXiv : 1902.06630 . дои : 10.1101/552240 .

[:0-10] Перейти обратно: ^а ^б Швенк Ф., Барон У., Раевский К. (декабрь 1995 г.). «Кре-трансгенный штамм мышей для повсеместной делеции сегментов гена, окруженных loxP, включая делецию в зародышевых клетках» . Исследования нуклеиновых кислот . 23 (24): 5080–1. дои : 10.1093/нар/23.24.5080 . ПМК 307516 . ПМИД 8559668 .

[11] Гриффитс А.Дж., Миллер Дж.Х., Сузуки Д.Т., Левонтин Р.К., Гелбарт В.М. (2000). «Инверсии» . Введение в генетический анализ. 7-е издание .

[A_rapid_in_vitro_method_to_flip_bac-12] Перейти обратно: ^а ^б Сюй Дж, Чжу Ю (август 2018 г.). «Быстрый метод in vitro для переворачивания двойной перевернутой открытой рамки считывания в плазмиде» . БМК Биотехнология . 18 (1): 52. дои : 10.1186/s12896-018-0462-x . ПМК 6119287 . ПМИД 30170595 .

[13] Обердерфер П., Отипоби К.Л., Маруяма М., Раевски К. (ноябрь 2003 г.). «Однонаправленная Cre-опосредованная генетическая инверсия у мышей с использованием мутантной пары loxP lox66/lox71» . Исследования нуклеиновых кислот . 31 (22): 140д–140. дои : 10.1093/нар/gng140 . ПМЦ 275577 . ПМИД 14602933 .

[14] Гриффитс А.Дж., Миллер Дж.Х., Сузуки Д.Т., Левонтин Р.К., Гелбарт В.М. (2000). «Транслокации». Введение в генетический анализ (7-е изд.).

[15] Пугач Е.К., Ричмонд, Пенсильвания, Азофейфа Дж.Г., Доуэлл Р.Д., Лейнванд Л.А. (сентябрь 2015 г.). «Продолжительная экспрессия Cre, управляемая промотором тяжелой цепи α-миозина, может быть кардиотоксичной» . Журнал молекулярной и клеточной кардиологии . 86 : 54–61. дои : 10.1016/j.yjmcc.2015.06.019 . ПМЦ 4558343 . ПМИД 26141530 .

[16] Даниелян П.С., Муччино Д., Рович Д.Х., Майкл С.К., МакМахон А.П. (декабрь 1998 г.). «Модификация активности генов у эмбрионов мышей внутриутробно с помощью тамоксифен-индуцируемой формы рекомбиназы Cre» . Современная биология . 8 (24): 1323–6. Бибкод : 1998CBio....8.1323D . дои : 10.1016/s0960-9822(07)00562-3 . ПМИД 9843687 .

[17] Методы трансгенеза: принципы и протоколы . Кларк, Алан Р. (2-е изд.). Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. 2002. ISBN 9781592591787 . OCLC 50175106 . {{cite book}}: CS1 maint: другие ( ссылка )

[18] Рак и рыбки данио: механизмы, методы и модели . Лангенау, Дэвид М. Швейцария. 10 мая 2016 г. ISBN 9783319306544 . OCLC 949668674 . {{cite book}}: CS1 maint: отсутствует местоположение издателя ( ссылка ) CS1 maint: другие ( ссылка )

[19] Кобаяши К., Камей Ю., Киносита М., Черни Т., Танака М. (январь 2013 г.). «Индуцируемая нагреванием система индукции гена CRE/LOXP в Медаке». Бытие . 51 (1): 59–67. дои : 10.1002/dvg.22348 . ПМИД 23019184 . S2CID 25211137 .

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]

[15]

[16]

[17]

[18]

[19]