Характеристика липидного бислоя
Характеристика липидного бислоя — это использование различных оптических, химических и физических методов исследования для изучения свойств липидных бислоев. Многие из этих методов сложны и требуют дорогостоящего оборудования, поскольку фундаментальная природа липидного бислоя делает его очень трудной для изучения структурой. Отдельный бислой, поскольку его толщина составляет всего несколько нанометров, невидим в традиционной световой микроскопии. Бислой также является относительно хрупкой структурой, поскольку он полностью удерживается нековалентными связями и необратимо разрушается при удалении из воды. Несмотря на эти ограничения, за последние семьдесят лет были разработаны десятки методов, позволяющих исследовать структуру и функцию бислоев. Первый общий подход заключался в использовании неразрушающих измерений на месте, таких как дифракция рентгеновских лучей и электрическое сопротивление, которые измеряли свойства бислоя, но фактически не отображали бислой. Позже были разработаны протоколы для модификации бислоя и обеспечения его прямой визуализации сначала в электронный микроскоп , а в последнее время и флуоресцентную микроскопию . За последние два десятилетия новое поколение инструментов для определения характеристик, включая АСМ, позволило проводить прямое зондирование и визуализацию мембран in situ практически без химических или физических модификаций. Совсем недавно интерферометрия с двойной поляризацией была использована для измерения оптического двойного лучепреломления липидных бислоев, чтобы охарактеризовать порядок и нарушение, связанные с взаимодействиями или эффектами окружающей среды.
Флуоресцентная микроскопия
[ редактировать ]
Флуоресцентная микроскопия — это метод, с помощью которого определенные молекулы могут возбуждаться светом одной длины волны и излучать свет другой, более длинной волны. Поскольку каждая флуоресцентная молекула имеет уникальный спектр поглощения и излучения , можно определить местоположение определенных типов молекул. Природные липиды не флуоресцируют, поэтому для изучения липидных бислоев с помощью флуоресцентной микроскопии всегда необходимо включать молекулу красителя. В некоторой степени добавление молекулы красителя всегда меняет систему, и в некоторых случаях может быть трудно сказать, обусловлен ли наблюдаемый эффект липидами, красителем или, чаще всего, некоторой комбинацией того и другого. Краситель обычно прикрепляется либо к липиду, либо к молекуле, которая очень похожа на липид, но поскольку домен красителя относительно велик, он может изменить поведение этой другой молекулы. Это особенно спорный вопрос при изучении диффузии или фазового разделения липидов, поскольку оба процесса очень чувствительны к размеру и форме участвующих молекул.
Это потенциальное осложнение было аргументом против использования метода восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) для определения коэффициентов двухслойной диффузии. В типичном эксперименте FRAP небольшая область (диаметром около 30 мкм) фотообесцвечивается под воздействием интенсивного источника света. Затем эта область контролируется с течением времени по мере того, как «мертвые» молекулы красителя диффундируют и заменяются неповрежденными молекулами красителя из окружающего бислоя. Подгоняя эту кривую восстановления, можно рассчитать коэффициент диффузии бислоя. [1] [2] Аргументом против использования этого метода является то, что на самом деле изучается диффузия красителя, а не липида. [3] Хотя это различие и верно, оно не всегда важно, поскольку в подвижности красителя часто преобладает подвижность бислоя.
В традиционной флуоресцентной микроскопии разрешение ограничено примерно половиной длины волны используемого света. За счет использования конфокальной микроскопии и обработки изображений этот предел можно расширить, но обычно он не намного ниже 100 нанометров, что намного меньше, чем у типичной клетки, но намного больше, чем толщина липидного бислоя. Совсем недавно передовые методы микроскопии позволили при определенных обстоятельствах значительно увеличить разрешение, даже до субнанометровых. Одним из первых разработанных методов был резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET). В FRET две молекулы красителя выбираются так, чтобы спектр излучения одной перекрывал спектр поглощения другой. Эта передача энергии чрезвычайно зависит от расстояния, поэтому с ангстремным разрешением можно определить, насколько далеко друг от друга находятся два красителя. Это можно использовать, например, для определения момента слияния двух бислоев и смешивания их компонентов. [4] Еще одним методом микроскопии высокого разрешения является флуоресцентная интерференционно-контрастная микроскопия (FLIC). Этот метод требует, чтобы образец был установлен на отражающей поверхности, подвергнутой точной микрообработке. Изучая образующиеся деструктивные интерференционные картины, можно индивидуально разрешить два листка нанесенного бислоя и определить распределение флуоресцентного красителя в каждом. [5]
Электрический
[ редактировать ]
Электрические измерения — наиболее простой способ охарактеризовать одну из наиболее важных функций бислоя, а именно его способность сегрегировать и предотвращать поток ионов в растворе. Соответственно, электрическая характеристика была одним из первых инструментов, используемых для изучения свойств модельных систем, таких как черные мембраны. Уже было известно, что клеточная мембрана способна поддерживать ионный градиент и что этот градиент отвечает за способность нейронов посылать сигналы через потенциал действия . Демонстрация того, что подобные явления могут быть воспроизведены in vitro, стала важным подтверждением полезности модельных систем. [6]
По сути, все электрические измерения бислоев предполагают размещение электрода по обе стороны мембраны. Приложив смещение к этим электродам и измерив результирующий ток, можно определить сопротивление бислоя. Это сопротивление обычно довольно велико для неповрежденных бислоев, часто превышая 100 ГОм, поскольку гидрофобное ядро непроницаемо для заряженных гидратированных частиц. Поскольку это сопротивление настолько велико, наличие даже нескольких отверстий нанометрового размера приводит к резкому увеличению тока и может быть легко определено. [7] даже активность одиночных ионных каналов . Чувствительность этой системы такова, что можно разрешить [8] При таких измерениях постоянного тока необходимо использовать электрохимически активные электроды, чтобы обеспечить необходимые положительные заряды с одной стороны и отрицательные заряды с другой. Наиболее распространенной системой является электрод серебро/хлорид серебра, поскольку эта реакция стабильна, обратима, включает перенос одного электрона и может производить большие токи. [9] В дополнение к простым измерениям постоянного тока также можно выполнить электрические характеристики переменного тока для получения информации о емкости и комплексном импедансе бислоя. Поскольку емкость обратно пропорциональна толщине, а бислои очень тонкие, они обычно имеют очень большую емкость, порядка 2 мкФ/см. 2 . Измерения емкости особенно полезны при работе с черными липидными мембранами, поскольку их можно использовать для определения того, когда пробка растворитель/липид утончается до одного бислоя.
Оптический
[ редактировать ]Липиды представляют собой высокополярные молекулы , которые при самосборке в бислои создают с высоким двойным лучепреломлением. слой [10] где оптические свойства параллельных сильно отличаются от оптических свойств перпендикулярных. Этот эффект, изученный с помощью интерферометрии двойной поляризации, использовался для измерения динамической реорганизации слоя из-за температуры, ионной силы и молекулярных взаимодействий, например, с антимикробными пептидами.
Гидратированные бислои демонстрируют богатую колебательную динамику и являются хорошей средой для эффективной передачи колебательной энергии. Методами сверхбыстрой спектроскопии исследованы колебательные свойства монослоев и бислоев липидов. [11] и недавно разработанные вычислительные методы. [12]
АСМ
[ редактировать ]
Атомно-силовая микроскопия (АСМ) в последние годы используется для изображения и исследования физических свойств липидных бислоев. АСМ является многообещающим методом, поскольку он потенциально позволяет получать изображения с нанометровым разрешением при комнатной температуре и даже под водой, в условиях, необходимых для естественного поведения двухслойных слоев. Эти возможности позволили напрямую визуализировать тонкий пульсирующий фазовый переход в поддерживаемом бислое. [13] Другой эксперимент АСМ, выполненный в постукивающем режиме в водной буферной среде, позволил (1) определить образование трансмембранных пор (дырок) вокруг наночастиц диаметром примерно от 1,2 до 22 нм путем вычитания АСМ-изображений из серий, записанных во время формирования липидного бислоя и ( 2) наблюдать адсорбцию отдельных молекул инсулина на экспонированных наночастицах. [14] Еще одним преимуществом является то, что АСМ не требует флуоресцентной или изотопной маркировки липидов, поскольку кончик зонда механически взаимодействует с поверхностью бислоя. По этой причине одно и то же сканирование может выявить информацию как о бислое, так и о любых связанных с ним структурах, вплоть до разрешения отдельных мембранных белков. [15] Помимо визуализации, АСМ может также исследовать механическую природу небольших деликатных структур, таких как липидные бислои. Одно исследование продемонстрировало возможность измерения модуля упругости отдельных наноразмерных мембран, подвешенных над пористым анодным оксидом алюминия. [16]
Хотя АСМ является мощным и универсальным инструментом для изучения липидных бислоев, существуют некоторые практические ограничения и трудности. Из-за хрупкой природы бислоя чрезвычайно низкие силы сканирования (обычно 50 пН или менее). [13] [17] ) необходимо использовать во избежание повреждений. Это соображение особенно важно при изучении метастабильных систем, таких как везикулы, адсорбированные на подложке, поскольку наконечник АСМ может вызвать разрыв и другие структурные изменения. [18] Также необходимо позаботиться о выборе подходящего материала и подготовке поверхности для наконечника АСМ, поскольку гидрофобные поверхности могут сильно взаимодействовать с липидами и нарушать двухслойную структуру. [19]
Электронная микроскопия
[ редактировать ]
В электронной микроскопии с образцом взаимодействует пучок сфокусированных электронов , а не луч света, как в традиционной микроскопии. Электроны имеют гораздо более короткую длину волны, чем свет, поэтому электронная микроскопия имеет гораздо более высокое разрешение, чем световая микроскопия, потенциально вплоть до атомного масштаба. Поскольку липидные бислои расположены на молекулярном уровне, такое более высокое разрешение оказалось неоценимым. В 1960 году, когда структура бислоя все еще обсуждалась, именно электронная микроскопия позволила впервые напрямую визуализировать два прилегающих друг к другу листочка. [20] В сочетании с методами быстрого замораживания электронная микроскопия также использовалась для изучения механизмов меж- и внутриклеточного транспорта, например, для демонстрации того, что экзоцитозные везикулы являются средством химического высвобождения в синапсах . [21] Зачастую электронная микроскопия является единственным зондовым методом с достаточным разрешением для определения сложных морфологий нанометрового масштаба.
Ограничения электронной микроскопии при изучении липидных структур связаны, прежде всего, с пробоподготовкой. Большинство электронных микроскопов требуют, чтобы образец находился в вакууме, что несовместимо с гидратацией при комнатной температуре. Чтобы решить эту проблему, образцы можно визуализировать в криогенных условиях с замороженной водой или изготовить металлический негатив из замороженного образца. Обычно также необходимо окрасить бислой соединениями тяжелых металлов, такими как тетроксид осмия или ацетат уранила, поскольку компоненты липидов с низким атомным весом (углерод, азот, фосфор и т. Д.) Дают небольшой контраст по сравнению с водой. Если просвечивающий электронный микроскоп используется (ПЭМ), также необходимо разрезать или отполировать образец до очень тонкого (<1 микрометра) листа, что может быть затруднительно и отнимать много времени. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) не требует этого этапа, но не может обеспечить такое же разрешение, как ПЭМ. Оба метода чувствительны к поверхности и не могут выявить информацию о глубоко залегающих структурах.
Рассеяние нейтронов и рентгеновских лучей
[ редактировать ]И рентгеновские лучи, и нейтроны высоких энергий используются для исследования структуры и периодичности биологических структур, включая бислои, поскольку их можно настроить для взаимодействия с веществом на соответствующих масштабах длины (ангстрем-нм). Часто эти два класса экспериментов предоставляют дополнительную информацию, поскольку каждый из них имеет разные преимущества и недостатки. Рентгеновские лучи слабо взаимодействуют с водой, поэтому объемные образцы можно исследовать с относительно простой пробоподготовкой. Это одна из причин того, что рассеяние рентгеновских лучей было методом, впервые использованным для систематического изучения межбислоевого расстояния. [22] Рассеяние рентгеновских лучей также может дать информацию о среднем расстоянии между отдельными молекулами липидов , что привело к его использованию для характеристики фазовых переходов . [23] Одним из ограничений рентгеновских методов является то, что рентгеновские лучи относительно нечувствительны к легким элементам, таким как водород. Этот эффект является следствием того, что рентгеновские лучи взаимодействуют с веществом путем рассеяния на электронной плотности, которая уменьшается с уменьшением атомного номера. Напротив, нейтроны рассеиваются за счет ядерной плотности и ядерных магнитных полей, поэтому чувствительность не уменьшается монотонно с z . Этот механизм также обеспечивает в некоторых случаях сильный изотопный контраст, особенно между водородом и дейтерием , что позволяет исследователям настраивать экспериментальную базовую линию, смешивая воду и дейтерированную воду. Использование рефлектометрии вместо рассеяния нейтронов или рентгеновских лучей позволяет экспериментаторам исследовать поддерживаемые бислои или многослойные стопки. Эти измерения более сложны для анализа, но позволяют определить состав поперечного сечения, включая расположение и концентрацию воды внутри бислоя. [24] В случае измерений как нейтронного, так и рентгеновского рассеяния предоставленная информация представляет собой среднее по ансамблю системы и, следовательно, подвержена неопределенности, основанной на тепловых флуктуациях в этих высокоподвижных структурах. [25]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Д. Аксельрод, Д. Э. Коппель, Дж. Шлессингер, Э. Элсон и В. В. Уэбб. «Измерение подвижности путем анализа кинетики восстановления флуоресцентного фотообесцвечивания». Биофизический журнал . 16. (1976) 1055-69.
- ^ DM Soumpasis. «Теоретический анализ экспериментов по восстановлению флуоресцентного фотоотбеливания». Биофизический журнал. 41. (1983) 95-7.
- ^ WL Vaz и PF Almeida. «Микроскопическая и макроскопическая диффузия в однокомпонентных жидкофазных липидных бислойных мембранах». Биофизический журнал. 60. (1991) 1553-1554.
- ^ Л. Гохуа и Р. К. Макдональд. «Слияние липидных двухслойных пузырьков: промежуточные соединения, улавливаемые с помощью высокоскоростной микрофлуоресцентной спектроскопии». Биофизический журнал. 85. (2003) 1585-1599.
- ^ Дж. М. Крейн, В. Кисслинг и Л. К. Тамм. «Измерение липидной асимметрии в плоских поддерживаемых бислоях с помощью флуоресцентной интерференционной контрастной микроскопии». Ленгмюр. 21. (2005) 1377-1388.
- ^ П. Мюллер, Д.О. Рудин, Х.И. Тьен и У.К. Уэскотт. «Восстановление структуры клеточной мембраны in vitro и ее трансформация в возбудимую систему». Природа. 194. (1962) 979-980.
- ^ К.К. Меликов, В.А. Фролов, А. Щербаков, А.В. Самсонов, Ю.А. Чизмаджев и Л.В. Черномордик. «Индуцированные напряжением непроводящие предпоры и метастабильные одиночные поры в немодифицированном плоском липидном бислое» Биофизический журнал. 80. (2001) 1829–1836.
- ^ Э. Неер и Б. Сакманн. «Одноканальные токи, записанные с мембраны денервированных мышечных волокон лягушки» Природа. 286. (1976) 71-73.
- ^ Д.Т. Сойер, «Электрохимия для химиков». 2-е изд. 1995: Уайли Интерсайенс.
- ^ Алиреза Машаги и др. Оптическая анизотропия нанесенных липидных структур, исследованная методом волноводной спектроскопии, и ее применение для изучения кинетики формирования нанесенного липидного бислоя. Анал. хим., 80 (10), 3666–3676 (2008).
- ^ М. Бонн и др., Структурная неоднородность межфазной воды в липидных монослоях, выявленная с помощью поверхностно-специфической вибрационной спектроскопии насоса-зонда, J. Am. хим. Соц. 132, 14971–14978 (2010).
- ^ Миша Бонн и др., Межфазная вода облегчает перенос энергии, вызывая расширенные вибрации в мембранных липидах, J Phys Chem, 2012 http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp302478a
- ^ Jump up to: а б Т. Каасгаард, К. Лейди, Дж. Х. Кроу, О. Э. Моуритсен и К. Йоргенсен. «Температурно-контролируемая структура и кинетика пульсационных фаз в одно- и двухкомпонентных липидных бислоях на подложке» Биофизический журнал. 85. (2003) 350-360.
- ^ Ю. Ройтер, М. Орнатска, А. Р. Раммохан, Дж. Балакришнан, Д. Р. Гейне и С. Минко, Взаимодействие наночастиц с липидной мембраной , Nano Letters, vol. 8, вып. 3, стр. 941-944 (2008).
- ^ Р. П. Рихтер и А. Бриссон. «Характеристика липидных бислоев и белковых сборок, поддерживаемых на шероховатых поверхностях, с помощью атомно-силовой микроскопии». Ленгмюр. 19. (2003) 1632-1640.
- ^ С. Стелтенкамп, М. М. Мюллер, М. Дезерно, К. Хеннестал, К. Стейнем и А. Яншофф. «Механические свойства перекрывающих поры липидных бислоев, исследованные с помощью атомно-силовой микроскопии». Биофизический журнал. 91. (2006) 217-226.
- ^ SW Хуэй, Р. Висванатан, Дж. А. Засадзински и Дж. Н. Исраелачвили. «Структура и стабильность фосфолипидных бислоев по данным атомно-силовой микроскопии». Биофизический журнал. 68. (1995) 171-8.
- ^ К. Димитриевски, М. Зак, В. П. Жаданов и Б. Касемо. «Визуализация и манипулирование адсорбированными липидными везикулами с помощью наконечника АСМ: эксперимент и моделирование Монте-Карло». Коллоиды и поверхности Б. 47. (2006) 115-125.
- ^ Дж. Шнайдер, В. Баргер и Гу Ли. «Свойства поверхности нанесенных липидных бислоев в нанометровом масштабе, измеренные с помощью гидрофобных и гидрофильных зондов атомно-силового микроскопа». Ленгмюр. 19. (2003) 1899–1907.
- ^ Дж. Д. Робертсон. «Молекулярная структура и контактные взаимоотношения клеточных мембран». Прогресс биофизики и биофизической химии. 10. (1960) 343-418.
- ^ Дж. Э. Хойзер, Т. С. Риз, М. Дж. Деннис, Ю. Ян, Л. Ян и Л. Эванс. «Экзоцитоз синаптических везикул захватывается быстрым замораживанием и коррелирует с высвобождением квантового передатчика». Журнал клеточной биологии. 81. (1979) 275-300.
- ^ Д. Папахаджапулос и Н. Миллер. «Фосфолипидные модельные мембраны I. Структурные характеристики гидратированных жидких кристаллов». Биохимика и биофизика Acta. 135. (1967) 624-638.
- ^ DM Small. «Фазовые равновесия и структура сухого и гидратированного яичного лецитина» Journal of Lipid Research. 8. (1967) 551-557.
- ^ Г. Заккаи, Дж. К. Блази и Б. П. Шенборн. «Нейтронографические исследования местоположения воды в двухслойных модельных мембранах лецитина». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 72. (1975) 376-380.
- ^ Д. Боал, «Механика клетки». 2002, Кембридж, Великобритания: Издательство Кембриджского университета.