Эпистаз и функциональная геномика

Эпистаз относится к генетическим взаимодействиям, при которых мутация одного гена маскирует фенотипические эффекты мутации в другом локусе . Систематический анализ этих эпистатических взаимодействий может дать представление о структуре и функциях генетических путей. Изучение фенотипов, возникающих в результате парных мутаций, помогает понять, как пересекаются функции этих генов. Генетические взаимодействия обычно классифицируются как положительные/облегчающие или отрицательные/усугубляющие. Эпистаз приспособленности (взаимодействие между неаллельными генами ) является положительным (другими словами, уменьшающим, антагонистическим или буферным), когда мутация потери функции двух данных генов приводит к превышению приспособленности, предсказанной на основе индивидуальных эффектов вредных мутаций, и это отрицательный (то есть усиливающий, синергетический или усугубляющий), когда он снижает приспособленность. обычно положительный Рышард Корона и Лукас Яснос показали, что эпистатический эффект у Saccharomyces cerevisiae . Обычно даже в случае положительных взаимодействий двойной мутант имеет меньшую приспособленность, чем одиночные мутанты. Позитивные взаимодействия часто происходят, когда оба гена лежат в одном пути. И наоборот, негативные взаимодействия характеризуются еще более сильным дефектом, чем можно было бы ожидать в случае двух одиночных мутаций, а в самых крайних случаях (синтетические больные/летальные) двойная мутация оказывается летальной. Этот усугубленный фенотип возникает, когда оба гена в компенсаторных путях нокаутированы .

Высокопроизводительные методы анализа этих типов взаимодействий оказались полезны для расширения наших знаний о генетических взаимодействиях. Синтетические генетические массивы (SGA), синтетический анализ летальности на основе диплоидов на микрочипах (dSLAM) и профили эпистатических мини-чипов (E-MAP) являются тремя важными методами, которые были разработаны для систематического анализа и картирования генетических взаимодействий. Этот систематический подход к изучению эпистаза в масштабе всего генома имеет важное значение для функциональной геномики . Выявляя отрицательные и положительные взаимодействия между неизвестным геном и набором генов в рамках известного пути, эти методы могут выяснить функцию ранее не охарактеризованных генов в контексте метаболического пути или пути развития.

Выводящая функция: облегчение и усугубление мутаций.

Чтобы понять, как информация об эпистатических взаимодействиях связана с генными путями, рассмотрим простой пример дифференцировки клеток вульвы у C. elegans . Клетки дифференцируются от клеток Pn к клеткам Pn.p, от клеток VP к клеткам вульвы. Мутация lin-26 блокирует дифференцировку клеток Pn в клетки Pn.p. Мутанты лин-36 ведут себя аналогично, блокируя дифференцировку при переходе к клеткам ВП. В обоих случаях результирующий фенотип характеризуется отсутствием клеток вульвы, поскольку имеется блокировка вышележащего пути дифференцировки. Двойной мутант, у которого оба этих гена нарушены, демонстрирует эквивалентный фенотип, который не хуже, чем у любого одиночного мутанта. Нарушение верхнего уровня lin-26 маскирует фенотипический эффект мутации lin-36. в классическом примере смягчающего эпистатического взаимодействия.

С другой стороны, отягчающие мутации приводят к фенотипу, который хуже, чем кумулятивный эффект каждой отдельной мутации. Этот усугубленный фенотип указывает на наличие двух генов в компенсаторных путях. В случае одиночного мутанта параллельный путь способен компенсировать потерю нарушенного пути, однако в случае двойного мутанта действие этого компенсаторного пути также теряется, что приводит к наблюдаемому более драматичному фенотипу. Эту взаимосвязь было значительно легче обнаружить, чем более тонкие облегчающие фенотипы, и она широко изучалась на S. cerevisiae с помощью синтетического скрининга больных/летальных (SSL), который выявляет двойные мутанты со значительно сниженными темпами роста.

Следует отметить, что эти выводы анализа двойных мутантов, хотя они и применимы ко многим путям и мутантам, не являются универсальными. Например, гены могут действовать в противоположных направлениях в путях, так что нокаут обоих приводит к почти нормальному фенотипу, в то время как каждый отдельный мутант серьезно страдает (в противоположных направлениях). Хорошо изученный пример имеет место на раннем этапе развития дрозофилы, когда генные продукты генов горбуна и nanos присутствуют в яйце и действуют в противоположных направлениях, направляя формирование передне-заднего паттерна. Нечто подобное часто происходит в путях передачи сигнала, где нокаут отрицательного регулятора пути вызывает фенотип гиперактивации, тогда как нокаут положительно действующего компонента приводит к противоположному фенотипу. В линейных путях с единственным «выходом», когда нокаутные мутации в двух противоположно действующих генах сочетаются у одного и того же человека, фенотип двойного мутанта обычно такой же, как фенотип одиночного мутанта, нормальный генный продукт которого действует ниже по ходу транскрипции. путь.

Методы обнаружения мутантов SSL

SGA и dSLAM

Синтетические генетические массивы (SGA) и синтетический анализ летальности микрочипов на основе диплоидов (dSLAM) являются двумя ключевыми методами, которые использовались для идентификации синтетических больных летальных мутантов и характеристики отрицательных эпистатических связей. Секвенирование всего генома дрожжей позволило создать библиотеку нокаутных мутантов почти для каждого гена в геноме. Эти мутанты с молекулярным штрих-кодом значительно облегчают высокопроизводительные исследования эпистаза, поскольку их можно объединить и использовать для создания необходимых двойных мутантов. Подходы SGA и dSLAM основаны на этих нокаутных штаммах дрожжей, которые трансформируются/спариваются для создания двойных гаплоидных мутантов. Затем используется профилирование микрочипов для сравнения приспособленности этих одиночных и двойных мутантов. В случае SGA исследованные двойные мутанты являются гаплоидными и собираются после скрещивания с мутантным штаммом с последующим несколькими раундами отбора. Штаммы dSLAM как с одинарными, так и с двойными мутантами происходят от одного и того же диплоидного гетерозиготного штамма (обозначенного «диплоидом» от «dSLAM»). В случае анализа dSLAM пригодность одиночных и двойных мутантов оценивают с помощью микроматричного анализа анализа конкуренции роста.

Эпистатические мини-профили (E-MAP)

Чтобы глубже понять генетические взаимодействия, экспериментальные подходы отходят от бинарной классификации фенотипов как дикого типа или синтетических летальных. Подход E-MAP особенно привлекателен из-за его способности выявлять как смягчающие, так и отягчающие эффекты, и именно эта способность отличает этот метод от других, таких как SGA и dSLAM. Более того, E-MAP не только идентифицирует оба типа взаимодействий, но также распознает градации этих взаимодействий и тяжесть замаскированного фенотипа, представленного оценкой взаимодействия, применяемой к каждой паре генов.

E-MAP используют подход SGA для высокопроизводительного анализа генетических взаимодействий . Хотя этот метод был специально разработан для изучения эпистаза у S. cerevisiae, его можно применять к другим модельным организмам и . E-MAP сопоставляет данные, полученные в результате систематического создания штаммов с двойными мутантами для большой четко определенной группы генов. Каждый фенотипический ответ оценивается количественно путем визуализации размера колонии для определения скорости роста. Этот показатель приспособленности сравнивается с прогнозируемой приспособленностью для каждого отдельного мутанта, в результате чего получается показатель генетического взаимодействия. Иерархическая кластеризация этих данных для группировки генов со схожими профилями взаимодействия позволяет идентифицировать эпистатические отношения между генами с известной функцией и без нее. При такой сортировке данных гены, о которых известно, что они взаимодействуют, будут группироваться вместе с генами, которые демонстрируют аналогичную модель взаимодействия, но функция которых еще не определена. Таким образом, данные E-MAP позволяют генам выполнять новые функции в рамках хорошо изученных путей. Рассмотрим, например, E-MAP, представленный Collins et al. который объединяет фактор элонгации транскрипции Dst1 наряду с компонентами средней области медиаторного комплекса, который участвует в регуляции транскрипции . Это предполагает новую роль Dst1, действующую совместно с Mediator.

Выбор генов, исследуемых в рамках данной E-MAP, имеет решающее значение для достижения плодотворных результатов. Особенно важно, что значительная часть исследованных генов хорошо известна в литературе. Таким образом, эти гены могут выступать в качестве контроля для E-MAP, обеспечивая большую уверенность при анализе данных от неохарактеризованных генов. Кластеры, организованные по субклеточной локализации и общим клеточным процессам (например, клеточному циклу ), дали хорошие результаты у S. cerevisiae. Данные исследований белок-белкового взаимодействия также могут стать полезной основой для выбора групп генов для данных E-MAP. Мы ожидаем, что гены, которые демонстрируют физические взаимодействия, также будут демонстрировать взаимодействия на генетическом уровне и, таким образом, могут служить адекватным контролем для данных E-MAP. Коллинз и др. (2007) провели сравнение показателей E-MAP и данных о физическом взаимодействии, полученных с помощью крупномасштабных методов аффинной очистки (AP-MS), и их данные показывают, что подход E-MAP идентифицирует белок-белковые взаимодействия со специфичностью, равной специфичности традиционные методы, такие как AP-MS.

Однако высокопроизводительные методы изучения эпистатических связей сталкиваются с трудностями, поскольку число возможных пар генов чрезвычайно велико (~ 20 миллионов у S. cerevisiae), а предполагаемая плотность генетических взаимодействий довольно низка. Этим трудностям можно противостоять, исследуя все возможные взаимодействия в одном кластере генов, а не исследуя пары по всему геному. При правильном выборе эти функциональные кластеры содержат значительно более высокую плотность генетических взаимодействий, чем другие области генома, и, таким образом, обеспечивают более высокий уровень обнаружения, одновременно значительно уменьшая количество пар генов, подлежащих исследованию.

Создание мутантных штаммов: DAMP.

Получение данных для E-MAP зависит от создания тысяч штаммов с двойными мутантами; например, исследование 483 аллелей привело к созданию E-MAP с примерно 100 000 различных пар двойных мутантов. Однако создание библиотек мутантов незаменимых генов представляет значительные трудности, поскольку эти мутации имеют летальный фенотип. Таким образом, исследования E-MAP основаны на штаммах с промежуточным уровнем экспрессии этих генов. Стратегия снижения численности за счет возмущения информационной РНК (DAmP) особенно характерна для высокопроизводительной генерации мутантов, необходимых для такого рода анализа, и позволяет частично разрушить важные гены без потери жизнеспособности. DAMP основан на дестабилизации транскриптов мРНК путем интеграции антибиотиком селектируемого маркера в 3'UTR, расположенного ниже стоп-кодона (рис. 2). мРНК с 3'-расширенными транскриптами быстро подвергаются деградации, в результате чего происходит подавление интересующего гена, в то время как он остается под контролем своего нативного промотора. В случае несущественных генов можно использовать делеционные штаммы. Маркировка участков делеции молекулярными штрих-кодами, уникальными последовательностями длиной 20 пар оснований, позволяет идентифицировать и изучать относительные уровни приспособленности каждого мутантного штамма.