ЦиТОФ
Цитометрия по времени полета , или CyTOF , представляет собой применение массовой цитометрии, используемое для количественного определения меченых мишеней на поверхности и внутри отдельных клеток. CyTOF позволяет одновременно проводить количественную оценку нескольких клеточных компонентов с помощью детектора ICP-MS .
CyTOF использует преимущества иммуномечения для количественного определения белков , углеводов или липидов в клетке. Мишени выбираются для ответа на конкретный исследовательский вопрос и помечаются антителами, меченными металлическими лантанидами . Меченые клетки распыляют и смешивают с нагретым аргоном для сушки ячейки, содержащей частицы. Смесь пробы и газа фокусируется и поджигается аргоновой плазменной горелкой . Это разбивает клетки на отдельные атомы и создает ионное облако. Обильные ионы небольшого веса, образующиеся из окружающего воздуха и биологических молекул, удаляются с помощью квадрупольного масс-анализатора . Оставшиеся тяжелые ионы из меток антител количественно определяют с помощью времяпролетной масс-спектрометрии . [ 1 ] Содержание ионов коррелирует с количеством мишени на клетку и может использоваться для определения клеточных качеств. [ 2 ]
Чувствительность масс-спектрометрии к обнаружению различных ионов позволяет измерять более 50 мишеней на клетку, избегая при этом проблем со спектральным перекрытием, наблюдаемых при использовании флуоресцентных зондов. [ 3 ] [ 4 ] Однако эта чувствительность также означает, что следы загрязнения тяжелыми металлами вызывают беспокойство. [ 5 ] Использование большого количества зондов создает новые проблемы при анализе генерируемых многомерных данных. [ 6 ]
История
[ редактировать ]В 1994 году Цутому Номидзу и его коллеги из Университета Нагои провели первые эксперименты по масс-спектрометрии отдельных клеток. Номидзу понял, что отдельные клетки можно распылять, сушить и поджигать в плазме, чтобы генерировать облака ионов, которые можно обнаружить с помощью эмиссионной спектрометрии. [ 7 ] В экспериментах этого типа можно было определить количество таких элементов, как кальций, внутри клетки. Вдохновленный проточной цитометрией, в 2007 году Скотт Д. Таннер разработал на основе этой ИСП-МС первый мультиплексный анализ с использованием металлов-лантанидов для мечения ДНК и маркеров клеточной поверхности. [ 8 ] В 2008 году Таннер описал тандемное присоединение проточного цитометра к прибору ИСП-МС, а также новые метки антител, которые позволят проводить массовый мультиплексный анализ клеточных маркеров. [ 9 ] Путем дальнейшей оптимизации скорости обнаружения и чувствительности этого потока в сочетании с ИСП-МС они создали первый прибор CyTOF. [ 1 ]
Прибор CyTOF изначально принадлежал канадской компании DVS Sciences, но теперь является эксклюзивным продуктом Fluidigm после приобретения в 2014 году компании DVS Sciences. В 2022 году Fluidigm получила вливание капитола и сменила название на Standard BioTools. [ 10 ] Было 4 итерации аппарата CyTOF под названиями CyTOF, CyTOF2, Helios™. [ 5 ] и CyTOF XT. [ 11 ] Последовательные улучшения заключались в основном в увеличении дальности обнаружения и параметров программного обеспечения: прибор Helios способен обнаруживать металлы в диапазоне от иттрия-89 до висмута-209, а также обеспечивать пропускную способность и анализировать 2000 событий в минуту.
Рабочий процесс
[ редактировать ]Группа элементов лантаноидов используется для мечения антител , поскольку фон в биологических образцах очень низкий. [ 12 ] При выборе подходящего изотопа для биомаркера биомаркеры с низкой экспрессией следует сочетать с изотопом, имеющим высокую интенсивность сигнала. [ 13 ] Если необходимо использовать менее чистый изотоп, его следует сочетать с биомаркером с низкой экспрессией, чтобы свести к минимуму любое неспецифическое связывание или фон.
Изотопные полимеры создаются с использованием диэтилентриаминпентауксусной кислоты (ДТПА) хелатора для связывания ионов вместе. [ 13 ] Полимер оканчивается тиолом или малеимидом , который связывает его с восстановленными дисульфидами в Fc-области антитела. [ 14 ] С антителом связано от четырех до пяти полимеров, в результате чего на антитело приходится около 100 атомов изотопа. [ 14 ] Меченые антитела могут находиться в растворе, конъюгированы с гранулами или иммобилизованы на поверхности. Окрашивание клеток происходит по тем же процедурам, что и флуоресцентное окрашивание для проточной цитометрии. [ 14 ]
Чтобы отличить живые клетки от мертвых, клетки можно исследовать с помощью родия , интеркалятора , который может проникать только в мертвые клетки. Затем все клетки фиксируются и окрашиваются иридием , который проникает во все клетки, чтобы можно было визуализировать, какие из них живые. [ 14 ]
Метод введения клеток в масс-цитометре представляет собой инъекцию аэрозольного сплиттера. [ 13 ] Затем клетки захватываются потоком газообразного аргона , а затем транспортируются в плазму, где они испаряются, распыляются и ионизируются. Ячейка теперь представляет собой облако ионов, которое переходит в центр ионной оптики. Затем времяпролетный анализатор используется для измерения массы ионов.
Анализ данных
[ редактировать ]Ионы ускоряются через спектрометр импульсами. Электронное облако, генерируемое одной ячейкой, обычно составляет 10–150 импульсов. Результатом запуска Helios™ является файл двоичных интегрированных массовых данных (IMD), который содержит интенсивность электронов, измеренную от ионов для каждого массового канала. Непрерывные импульсы должны быть разделены на отдельные события ячейки, соответствующие ионному облаку, генерируемому одной ячейкой. Каждый интервал из 10–150 импульсов, который превышает установленный пользователем нижний порог свертки, рассматривается программным обеспечением Helios™ как событие ячейки. [ 1 ] [ 5 ] Нижний порог свертки — это минимальное количество ионов, которое должно быть достигнуто во всех ионных каналах, чтобы считаться клеточным событием. Значение этого параметра увеличивается с увеличением количества измеряемых ионов, поэтому при использовании большего количества меток для определения события в клетке требуется больше счетчиков. [ 5 ]
Для анализа данных файл IMD преобразуется в формат стандарта проточной цитометрии (FCS). Этот файл содержит общее количество ионов для каждого канала для каждой клетки, расположенной в матрице, и представляет собой тот же файл, который создается во время проточной цитометрии . [ 5 ] Эти данные могут быть обработаны вручную, как это делается для проточной цитометрии, и большинство инструментов, доступных для анализа проточной цитометрии, были перенесены в CyTOF (см. Биоинформатика проточной цитометрии ). [ 6 ] Данные CyTOF обычно имеют большую размерность . Для разграничения связей между популяциями клеток уменьшения размерности часто используются алгоритмы . Распространены несколько алгоритмов кластеризации многомерного анализа. Популярные инструменты включают tSNE , FlowSOM и псевдовремя диффузии (DPT). [ 6 ] Дальнейшие методы анализа зависят от целей исследования.
Приложения
[ редактировать ]CyTOF предоставляет важную информацию на уровне отдельных клеток об экспрессии белка, иммунофенотипе и функциональных характеристиках. Это ценный инструмент в иммунологии , где большое количество параметров помогло выяснить работу этой сложной системы. [ 15 ] [ 13 ] Например, естественные клетки-киллеры обладают разнообразными свойствами, на которые влияют многочисленные маркеры в различных комбинациях, которые невозможно было легко проанализировать до появления этой технологии. [ 16 ] Одновременное измерение множества биомаркеров позволяет идентифицировать более 30 различных подмножеств иммунофенотипов в одной сложной группе клеток. [ 15 ] Это может помочь более полно охарактеризовать иммунную функцию, инфекционные заболевания и рак, а также понять реакцию клеток на терапию.
Преимущества и недостатки
[ редактировать ]Основным преимуществом CYTOF является возможность исследовать большее количество параметров на панели, чем другие методы цитометрии. Это позволяет лучше понять сложные и гетерогенные популяции клеток без необходимости использования множества сложных и перекрывающихся панелей. Панели могут включать до 45 антител, в отличие от 10, которые можно получить при традиционной проточной цитометрии, но для их разработки требуется большой опыт. [ 15 ] Однако развитие спектральной проточной цитометрии закрыло разрыв между проточной и массовой цитометрией с точки зрения максимального количества антител, которые можно использовать. Большее количество антител на панель экономит время, позволяет понять более широкую картину и требует меньшего количества клеток на эксперимент, что особенно выгодно, когда образцы ограничены, например, при исследованиях опухолей. [ 4 ]
Использование изотопов тяжелых металлов также снижает фон по сравнению с использованием флуоресцентных антител. Некоторые типы клеток, такие как миелоидные клетки, имеют высокие показатели автофлуоресценции, что создает много фонового шума при проточной цитометрии. [ 4 ] Однако используемые редкие изотопы тяжелых металлов не присутствуют в биологических системах, поэтому фоновый фон очень мал или вообще отсутствует, а общая чувствительность повышается. [ 4 ] Перекрытие обнаружения между различными тяжелыми металлами также очень мало по сравнению с перекрытием, наблюдаемым при флуоресцентной цитометрии, что значительно упрощает создание панели из многих маркеров.
Флуоресцентные красители подвергаются фотообесцвечиванию, при этом весь процесс должен происходить в течение нескольких часов после окрашивания. Однако антитела с металлическими метками жизнеспособны до двух недель без потери сигнала, что добавляет экспериментам большую гибкость. Окрашенные образцы также можно криоконсервировать, что может быть особенно полезно для клинических испытаний, когда образцы собираются в течение более длительного периода времени. [ 4 ]
Стоимость CyTOF высока, поскольку меченные металлом антитела и наборы для соединения антител дороги. Основным недостатком CyTOF является то, что скорость сбора данных довольно медленная по сравнению с проточной цитометрией, почти на порядок. [ 13 ] [ 4 ] Поскольку тяжелые металлы часто встречаются в лабораторных реагентах, очень важно избегать загрязнения во время подготовки проб.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Перейти обратно: а б с Дмитрий Бандура ; Владимир Баранов ; Ольга Орнатская ; Скотт Д. Таннер ; Антонов А; Кинач Р; Лу Икс; Павлов С; Воробьев С; Дик Дж. Э. (август 2009 г.). «Массовая цитометрия: метод многоцелевого иммуноанализа отдельных клеток в реальном времени на основе времяпролетной масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой». Аналитическая химия . 81 (16): 6813–22. дои : 10.1021/ac901049w . ПМИД 19601617 .
- ^ Ван В., Су Б., Пан Л., Цяо Л., Фэн Ю., Оуян Ю. и др. (июнь 2020 г.). «Многомерное иммунное профилирование методом массовой цитометрии выявило иммуносупрессию и дисфункцию иммунитета у пациентов с COVID-19» . Клеточная и молекулярная иммунология . 17 (6): 650–652. дои : 10.1038/s41423-020-0447-2 . ПМЦ 7186533 . ПМИД 32346099 .
- ^ Спитцер М.Х., Нолан Г.П. (май 2016 г.). «Массовая цитометрия: отдельные клетки, множество функций» . Клетка . 165 (4): 780–91. дои : 10.1016/j.cell.2016.04.019 . ПМК 4860251 . ПМИД 27153492 .
- ^ Перейти обратно: а б с д и ж Гадалла Р., Ноамани Б., Маклауд Б.Л., Диксон Р.Дж., Го М., Сюй В. и др. (2019). «Валидация CyTOF по сравнению с проточной цитометрией для иммунологических исследований и мониторинга клинических исследований рака у человека» . Границы онкологии . 9 : 415. doi : 10.3389/fonc.2019.00415 . ПМК 6534060 . ПМИД 31165047 .
- ^ Перейти обратно: а б с д и Олсен Л.Р., Лейпольд М.Д., Педерсен CB, Мекер Х.Т. (февраль 2019 г.). «Анатомия данных масс-цитометрии отдельных клеток» . Цитометрия. Часть А. 95 (2): 156–172. doi : 10.1002/cyto.a.23621 . ПМИД 30277658 .
- ^ Перейти обратно: а б с Палит С., Хойзер С., де Алмейда Г.П., Тайс Ф.Дж., Зелински К.Э. (2019). «Решение проблем многомерного анализа одноклеточных данных в иммунологии» . Границы в иммунологии . 10 :1515. дои : 10.3389/fimmu.2019.01515 . ПМК 6634245 . ПМИД 31354705 .
- ^ Номидзу Т., Канеко С., Танака Т., Ито Д., Кавагути Х., Валле Б.Т. (01.10.1994). «Определение содержания кальция в отдельных биологических клетках методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой». Аналитическая химия . 66 (19): 3000–3004. дои : 10.1021/ac00091a004 .
- ^ Таннер С.Д., Орнацкий О., Бандура Д.Р., Баранов В.И. (март 2007 г.). «Мультиплексный биоанализ с масс-спектрометрией с индуктивно связанной плазмой: на пути к массовой многомерной одноклеточной технологии». Spectrochimica Acta Часть B: Атомная спектроскопия . 62 (3): 188–195. Бибкод : 2007AcSpe..62..188T . дои : 10.1016/j.sab.2007.01.008 .
- ^ Таннер С.Д., Бандура Д.Р., Орнацкий О., Баранов В.И., Нитц М., Винник М.А. (01 января 2008 г.). «Проточный цитометр с масс-спектрометрическим детектором для массового мультиплексного анализа одноклеточных биомаркеров» . Чистая и прикладная химия . 80 (12): 2627–2641. дои : 10.1351/pac200880122627 . S2CID 53364129 .
- ^ «Стандартные биоинструменты | Пресс-релизы | Fluidigm Capital Infusion» . www.globenewswire.com . Проверено 22 января 2022 г.
- ^ «Выпущен CyTOF XT» (21 мая 2021 г.) . Флюидигма .
- ^ Орнатский О.И., Кинач Р., Бандура Д.Р., Лу X, Таннер С.Д., Баранов В.И. и др. (28 марта 2008 г.). «Разработка аналитических методов мультиплексного биоанализа с масс-спектрометрией с индуктивно связанной плазмой» . Журнал аналитической атомной спектрометрии . 23 (4): 463–469. дои : 10.1039/B710510J . ПМК 2600572 . ПМИД 19122859 .
- ^ Перейти обратно: а б с д и Чаттопадхай П.К., Родерер М. (июль 2012 г.). «Цитометрия: современные технологии и горизонты завтрашнего дня» . Методы . Проточная цитометрия и сортировка клеток: следующее поколение. 57 (3): 251–8. дои : 10.1016/j.ymeth.2012.02.009 . ПМК 3374038 . ПМИД 22391486 .
- ^ Перейти обратно: а б с д Таннер С.Д., Баранов В.И., Орнацкий О.И., Бандура Д.Р., Георгий Т.С. (май 2013 г.). «Введение в массовую цитометрию: основы и приложения» . Иммунология рака, иммунотерапия . 62 (5): 955–65. дои : 10.1007/s00262-013-1416-8 . ПМК 11029414 . ПМИД 23564178 . S2CID 8607382 .
- ^ Перейти обратно: а б с Бьёрнсон З.Б., Нолан Г.П., Фантл В.Дж. (август 2013 г.). «Одноклеточная массовая цитометрия для анализа функционального состояния иммунной системы» . Современное мнение в иммунологии . Патогены-хозяева / Иммунное старение. 25 (4): 484–94. дои : 10.1016/j.coi.2013.07.004 . ПМЦ 3835664 . ПМИД 23999316 .
- ^ Лейпольд, доктор медицинских наук, Ньюэлл Э.В., Мекер Х.Т. (2015). «Многопараметрическое фенотипирование РВМС человека с использованием массовой цитометрии». В Шоу AC (ред.). Иммуностарение . Методы молекулярной биологии. Том. 1343. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Спрингер. стр. 81–95. дои : 10.1007/978-1-4939-2963-4_7 . ISBN 978-1-4939-2963-4 . ПМЦ 4748856 . ПМИД 26420710 .