Физическое картографирование

Физическая карта — это метод, используемый в молекулярной биологии для определения порядка и физического расстояния между парами оснований ДНК с помощью маркеров ДНК . Это один из методов картирования генов , который позволяет с высокой точностью определить последовательность пар оснований ДНК. Генетическое картирование , еще один подход к картированию генов, может предоставить маркеры, необходимые для физического картирования. Однако, поскольку первый определяет относительное положение гена по частотам рекомбинации , он менее точен, чем второй.

Физическое картирование использует фрагменты ДНК и маркеры ДНК для сборки более крупных фрагментов ДНК. С перекрывающимися областями фрагментов, исследователи могут определить положение оснований ДНК. Существуют различные методы визуализации местоположения гена, включая гибридизацию соматических клеток , радиационную гибридизацию и гибридизацию in situ .

Доступны различные подходы к физическому картированию для анализа генома разных размеров и достижения разных уровней точности. Картирование с низким и высоким разрешением — это два класса для различного разрешения генома, особенно для исследования хромосом . Тремя основными разновидностями физического картирования являются флуоресцентная in situ гибридизация (FISH), картирование сайтов рестрикции и секвенирование с помощью клонов.

Целью физического картирования, как обычного механизма геномного анализа, является получение полной последовательности генома, чтобы выявить любую связь между целевой последовательностью ДНК и фенотипическими признаками . Если известно фактическое положение генов, контролирующих определенные фенотипы , можно решить проблему генетических заболеваний, предоставив рекомендации по профилактике и разработке новых методов лечения.

Картографирование с низким разрешением

Физическое картирование с низким разрешением обычно позволяет распознавать ДНК в диапазоне от одной пары оснований до нескольких мегаоснований. В этой категории большинство методов картирования включают создание гибридной панели соматических клеток , которая способна картировать любые последовательности ДНК человека, интересующий ген. , к определенным хромосомам клеток животных, например мышей и хомяков. Панель гибридных клеток получают путем сбора линий гибридных клеток , содержащих хромосомы человека, идентифицированных с помощью скрининга полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с праймерами, специфичными к интересующей последовательности человека, в качестве зонда гибридизации . Человеческая хромосома будет представлена во всех клеточных линиях.

Существуют различные подходы к созданию физического картирования с низким разрешением, включая хромосомно-опосредованный перенос генов и перенос генов, слитых с помощью облучения, которые создают панель гибридных клеток. Хромосомно-опосредованный перенос генов — это процесс, при котором соосаждаются фрагменты хромосом человека с фосфатом кальция на клеточную линию, что приводит к стабильной трансформации хромосом-реципиентов с сохранением человеческих хромосом размером от 1 до 50 мегапар оснований. Перенос генов слияния с облучением приводит к образованию радиационных гибридов, которые содержат интересующую человеческую последовательность и случайный набор других фрагментов человеческой хромосомы. Маркеры из фрагментов человеческой хромосомы в радиационных гибридах дают образцы перекрестной реактивности, которые в дальнейшем анализируются для создания карты радиационного гибрида путем упорядочивания маркеров и точек останова. Это дает данные о том, расположены ли маркеры на одном и том же фрагменте хромосомы человека, и, следовательно, о порядке последовательности генов.

Картографирование высокого разрешения

Физическое картирование с высоким разрешением может разрешить сотни тысяч оснований в одном нуклеотиде ДНК. Основным методом картирования таких больших областей ДНК является FISH-картирование высокого разрешения , которое может быть достигнуто путем гибридизации зондов с расширенными интерфазными хромосомами или искусственно расширенным хроматином . Поскольку их иерархическая структура менее конденсирована по сравнению с прометафазными и метафазными хромосомами, стандартной мишенью гибридизации in situ , можно получить физическое картирование с высоким разрешением.

FISH-картирование с использованием интерфазной хромосомы является традиционным методом in situ для картирования последовательностей ДНК размером от 50 до 500 тысяч нуклеотидов, которые в основном представляют собой синтенные клоны ДНК. Однако естественно расширенные хромосомы могут сворачиваться и создавать альтернативные порядки физических карт. В результате необходим статистический анализ для создания точного порядка расположения интерфазных хромосом на карте.

Если вместо этого использовать искусственно растянутый хроматин, разрешение картирования может превысить 700 килобаз. Чтобы получить расширенные хромосомы на предметном стекле, часто проводят прямую визуальную гибридизацию (DIRVISH), при которой клетки лизируются детергентом, чтобы позволить ДНК, высвободившейся в раствор, течь к другому концу предметного стекла. Примером FISH-картирования высокого разрешения с использованием растянутого хроматина является FISH с расширенными волокнами хроматина (ECF). Метод предлагает порядок желаемых областей в последовательности ДНК путем анализа частичных перекрытий и пробелов между искусственными хромосомами дрожжей (YAC). В конце концов, можно было определить линейную последовательность интересующих участков ДНК. Еще следует отметить, что если метафазная хромосома используется при картировании FISH, полученное разрешение будет очень плохим, и его следует отнести к картированию с низким разрешением, а не к картированию с высоким разрешением.

Сопоставление сайтов ограничений

Рестрикционное картирование — это нисходящая стратегия, которая делит хромосому-мишень на более мелкие области. Ферменты рестрикции используются для переваривания хромосомы и получения упорядоченного набора фрагментов ДНК. Он включает в себя геномные фрагменты мишени, а не клонированные фрагменты в библиотеке. Они будут прикреплены к зондам из геномной библиотеки, выбранным случайным образом для целей обнаружения. Длины фрагментов измеряются электрофорезом , который можно использовать для определения их расстояния по карте в соответствии с сайтом рестрикции , маркерами физической карты. Прогресс связан с комбинаторными алгоритмами.

В ходе процесса хромосому получают из гибридной клетки и разрезают по редкому сайту рестрикции, чтобы получить большие фрагменты. Фрагменты будут разделены по размеру и подвергнуты гибридизации, образуя карту макрорестрикций и разные смежные блоки (т.е. контиги ). Чтобы гарантировать связь фрагментов, можно использовать связывание клонов с одинаковыми редкими участками разреза на крупных фрагментах.

После создания карты с низким разрешением фрагменты можно разрезать на более мелкие участки с помощью нуклеаз рестрикции для дальнейшего анализа для создания карты с более высоким разрешением. Фракционирование PFG можно использовать для разделения и очистки фрагментов, образующихся при небольшом геноме.

Благодаря различным подходам переваривания образуются разные типы фрагментов ДНК. Изменение типов фрагментов может повлиять на результат расчета.

Двойное пищеварение

В этом методе используются два фермента рестрикции и комбинация двух ферментов для пищеварения по отдельности. Предполагается, что полное переваривание происходит в каждом сайте рестрикции. Длины фрагментов ДНК измеряются и используются для упорядочивания фрагментов путем вычислений. Этот подход проще в экспериментальной реализации, но более сложен с точки зрения комбинаторной задачи, необходимой для отображения.

Частичное пищеварение

В этом методе используется один фермент рестрикции для переваривания нужной ДНК в отдельных экспериментах с разной продолжительностью воздействия. Степень переваривания фрагментов различна. Метилирование ДНК — это метод, который предотвращает завершение реакции в местах разрезания. Этот метод необходимо использовать более тщательно, но его математическую задачу можно легко решить с помощью экспоненциального алгоритма .

Секвенирование клонами

Использование клонов для создания физической карты — это восходящий подход с довольно высоким разрешением. Он использует существующие клонированные фрагменты в геномных библиотеках для формирования контигов. Путем клонирования частично переваренных фрагментов, полученных в результате бактериальной трансформации, получают иммортализованные клоны с перекрывающимися областями генома, которые будут исследованы методами дактилоскопии и сохранены в библиотеках. В процессе секвенирования клоны случайным образом отбираются и случайным образом помещаются на набор микротитровальных планшетов . У них будут снимать отпечатки пальцев разными методами. Чтобы гарантировать наличие минимального набора клонов, образующих одну конфигурацию генома (т. е. путь тайла), используемая библиотека будет иметь пяти-десятикратную избыточность. Однако такие методы могут привести к появлению неизвестных пробелов в созданной карте или в конечном итоге привести к насыщению клонов.

Приложение

Физическое картирование — это метод завершения секвенирования генома. Текущие проекты, определяющие последовательности пар оснований ДНК, а именно Проект «Геном человека» , дают знания о порядке нуклеотидов и позволяют проводить дальнейшие исследования для ответа на генетические вопросы, в частности, о связи между целевой последовательностью и развитием признаков. Из отдельной последовательности ДНК, выделенной и нанесенной на физическое картирование, она может предоставить информацию о процессе транскрипции и трансляции во время развития организмов, тем самым определяя конкретную функцию гена и связанные с ним характеристики. В результате понимания экспрессии и регуляции генов можно разработать новые методы лечения, позволяющие изменить характер экспрессии белков в конкретных тканях . Более того, если идентифицировано расположение и последовательность генов заболевания, потенциальным пациентам, являющимся носителями гена заболевания, можно дать медицинскую консультацию со ссылкой на знание функции гена и продуктов.