Клоногенный анализ
Клоногенный анализ — это метод клеточной биологии, предназначенный для изучения эффективности специфических агентов на выживаемость и пролиферацию клеток. Его часто используют в лабораториях по исследованию рака для определения воздействия лекарств или радиации на пролиферирующие опухолевые клетки. [1] а также для титрования частиц, убивающих клетки (CKP) в вирусных запасах. [2] Впервые он был разработан Т.Т. Паком и Филипом И. Маркусом в Университете Колорадо в 1955 году. [3]
Хотя этот метод может обеспечить точные результаты, анализ требует много времени для настройки и анализа и может предоставить данные только о опухолевых клетках, которые могут расти в культуре. Слово «клоногенный» относится к тому факту, что эти клетки являются клонами друг друга.
Процедура
[ редактировать ]Эксперимент включает в себя три основных этапа:
- Лечение применяется к образцу клеток.
- Клетки «высеивают» в сосуд для тканевой культуры и оставляют расти.
- Полученные колонии фиксируют, окрашивают и подсчитывают.
По завершении эксперимента измеряют процент клеток, переживших обработку. Графическое представление зависимости выживаемости от концентрации лекарства или дозы ионизирующего излучения называется кривой выживания клеток . [4]
В анализах частиц, убивающих клетки , выжившая фракция клеток используется для аппроксимации распределения Пуассона вирусных частиц среди клеток и, следовательно, для определения количества CKP, с которыми сталкивается каждая клетка.
В эксперименте можно использовать любой тип клеток , но поскольку целью этих экспериментов в онкологических исследованиях является открытие более эффективных методов лечения рака, типичным выбором являются опухолевые клетки человека. Клетки либо получают из подготовленных «клеточных линий», которые хорошо изучены и чьи общие характеристики известны, либо из биопсии опухоли у пациента. [5] Клетки помещают в чашки Петри или в чашки, содержащие несколько круглых «лунок». Определенное количество клеток высеивается в зависимости от эксперимента; для экспериментов, связанных с облучением, обычно высевают большее количество клеток с увеличением дозы радиации. Например, при дозе радиации 0 или 1 грей можно высеять 500 клеток, а при дозе 4 или 5 грей можно высеять 2500, поскольку при этом уровне радиации погибает очень большое количество клеток и эффекты специфическое лечение будет ненаблюдаемым.
Подсчет клеточных колоний обычно проводится под микроскопом и является довольно утомительным занятием. Недавно были разработаны машины, использующие алгоритмы для анализа изображений. [6] Они фиксируются либо сканером изображений , либо автоматизированным микроскопом, который может полностью автоматизировать процесс подсчета. [7] Одна из таких автоматизированных машин работает, принимая определенные типы клеточных пластинок через слот (что-то вроде проигрывателя компакт-дисков), делая фотографии и загружая их в компьютер для немедленного анализа. Надежные подсчеты доступны в считанные секунды.
Переменные
[ редактировать ]Лечение обычно представляет собой медикаментозное лечение , ионизирующее излучение или их комбинацию. [8] Некоторые текущие исследования изучают усиление эффектов лекарств за счет одновременного облучения — синергетический эффект — и в этой ситуации изучаются две группы: контрольная группа, которую не лечат препаратом; и группу лечения, которую лечат препаратом. Обе группы облучены. Если наклоны их кривых выживаемости существенно различаются, то потенцирующий эффект может быть очевиден и подлежит дальнейшему изучению. Поскольку многие опухолевые клетки не образуют колонии в культуре, в качестве суррогата можно использовать анализ пролиферации клеток, который, как сообщается, имеет удовлетворительную точность при измерении синергетического эффекта между ионизирующим излучением и лекарствами. [9]
Подробное обсуждение многообещающих исследований, проводимых с помощью этого метода, выходит за рамки этой статьи, но некоторые исследования включают влияние экспрессии определенных генов или рецепторов на клетку, реакции различных типов клеток или синергетические реакции. Эффекты нескольких препаратов.
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Хоффман, Роберт М. (1991). «Анализ чувствительности in vitro при раке: обзор, анализ и прогноз». Журнал клинического лабораторного анализа . 5 (2): 133–43. дои : 10.1002/jcla.1860050211 . ПМИД 2023059 .
- ^ Нгунджири, Дж. М.; Секеллик, MJ; Маркус, ИП (2008). «Клоногенный анализ вирусов гриппа типа А выявляет неинфекционные частицы, убивающие клетки (индуцирующие апоптоз)» . Журнал вирусологии . 82 (6): 2673–80. дои : 10.1128/JVI.02221-07 . ПМК 2258965 . ПМИД 18184709 .
- ^ Стенограмма интервью TWiV@ http://www.twiv.tv/TWiV197-082612.pdf
- ^ Франкен, Николаас А.П.; Родермонд, Ханс М; Стап, Ян; Хавеман, Яап; Ван Бри, Крис (2006). «Клоногенный анализ клеток in vitro». Протоколы природы . 1 (5): 2315–9. дои : 10.1038/nprot.2006.339 . ПМИД 17406473 .
- ^ Гамбургер, Энн В. (1987). «Клоногенный анализ опухолей человека как модельная система в клеточной биологии». Международный журнал клонирования клеток . 5 (2): 89–107. дои : 10.1002/stem.5530050202 .
- ^ Ниязи, Максимилиан; Ниязи, Исмат; Белка, Клаус (2007). «Подсчет колоний в клоногенных анализах с использованием денситометрического программного обеспечения» . Радиационная онкология . 2 :4. дои : 10.1186/1748-717X-2-4 . ПМК 1770926 . ПМИД 17212832 .
- ^ Дале, Йостейн; Какар, Маниш; Стин, Харальд Б.; Каалхус, Олав (2004). «Автоматизированный подсчет колоний клеток млекопитающих с помощью планшетного сканера и обработки изображений». Цитометрия . 60А (2): 182–8. doi : 10.1002/cyto.a.20038 .
- ^ Карни, Д.Н.; Винклер, CF (1985). «Анализ химиотерапевтической чувствительности in vitro». Важные достижения в онкологии : 78–103. ПМИД 3916747 .
- ^ Лю, Кью; Мэн, Вт (2015). «Адаптация платформы скрининга лекарств для выявления связей молекулярно-направленных радиосенсибилизаторов с геномными биомаркерами» . Молекулярные исследования рака . 13 (4): 713–720. дои : 10.1158/1541-7786.MCR-14-0570 . ПМК 4410013 . ПМИД 25667133 .