Синтез наночастиц грибами

На протяжении всей истории человечества грибы использовались в качестве источника пищи и для ферментации и консервирования продуктов и напитков. В 20-м веке люди научились использовать грибы для защиты здоровья человека ( антибиотики , антихолестериновые статины и иммунодепрессанты), в то время как промышленность использовала грибы для крупномасштабного производства ферментов , кислот и биосурфактантов . ^{[ 1 ]} С появлением современных нанотехнологий в 1980-х годах грибы сохранили свою значимость, обеспечивая более экологичную альтернативу химически синтезированным наночастицам. ^{[ 2 ]}

Фон

Наночастица . определяется как имеющая одно измерение размером 100 нм или меньше В химическом синтезе наночастиц обычно участвуют экологически токсичные или биологически опасные восстановители. ^{[ 2 ]} поэтому начался поиск более экологически чистых альтернатив производства. ^{[ 3 ]}^{[ 4 ]} Текущие исследования показали, что микроорганизмы, растительные экстракты и грибы могут производить наночастицы биологическими путями. ^{[ 2 ]}^{[ 3 ]}^{[ 5 ]} Наиболее распространенными наночастицами, синтезируемыми грибами, являются серебро и золото , однако грибы использовались в синтезе других типов наночастиц, включая оксид цинка , платину , магнетит сульфида и селенида кадмия , диоксид циркония, кремнезем, титан, а также квантовые точки .

Производство наночастиц серебра

Синтез наночастиц серебра был исследован с использованием многих распространенных видов грибов, включая Trichoderma , ^{[ 6 ]}^{[ 7 ]} Фузариоз , ^{[ 8 ]} Пенициллиум , ^{[ 9 ]} Ризоктония , ^{[ нужна ссылка ]} Плеврот и Аспергилл . ^{[ 10 ]} Внеклеточный синтез был продемонстрирован Trichoderma virde , T. reesei , Fusarium oxysporm , F. semitectum , F. solani , Aspergillus niger , A. flavus , ^{[ 11 ]} A. fumigatus , A. clavatus , Pleurotus ostreatus , Cladosporium cladosporioides , ^{[ 6 ]} Penicillium brevicompactum , P. Fellutanum , эндофитный Rhizoctonia sp., Epicoccum nigrum , Chrysosporium tropicum и Phoma glomerata , в то время как было показано, что внутриклеточный синтез происходит у Verticillium. ^{[ 12 ]} видов и Neurospora crassa .

Производство наночастиц золота

Синтез наночастиц золота был исследован с использованием Fusarium . ^{[ 13 ]} Нейроспора , ^{[ 14 ]} Вертициллез , дрожжи, ^{[ 15 ]}^{[ 16 ]} и Аспергилл . Внеклеточный синтез наночастиц золота был продемонстрирован Fusarium oxysporum , Aspergillus niger и цитозольными экстрактами Candida albican . Внутриклеточный синтез наночастиц золота был продемонстрирован видом Verticillum , V. luteoalbum . ^{[ 17 ]}

Разное производство наночастиц

Помимо золота и серебра, Fusarium oxysporum использовался для синтеза наноразмерных частиц диоксида циркония, титана, сульфида кадмия и селенида кадмия. Наночастицы сульфида кадмия также были синтезированы Trametes versicolor , Schizosaccharomyces pombe и Candida glabrata . ^{[ 18 ]} Также было продемонстрировано, что гриб белой гнили Phanerochaete chrysosporium способен синтезировать наночастицы элементарного селена. ^{[ 19 ]}

Техники и условия культивирования

Методы культивирования и среды различаются в зависимости от требований используемого изолята гриба, однако общая процедура состоит из следующего: гифы грибов обычно помещают в жидкую питательную среду и помещают в встряхиваемую культуру до тех пор, пока биомасса грибковой культуры не увеличится. Грибковые гифы удаляют из питательной среды, промывают дистиллированной водой для удаления питательной среды, помещают в дистиллированную воду и инкубируют на встряхиваемой культуре в течение 24-48 часов. Грибковые гифы отделяют от надосадочной жидкости и аликвоту надосадочной жидкости добавляют к 1,0 мМ раствору ионов. Затем раствор ионов контролируют в течение 2–3 дней на предмет образования наночастиц. Другой распространенный метод культивирования заключается в добавлении промытых грибных гиф непосредственно в 1,0 мМ раствор ионов вместо использования грибкового фильтрата. Нитрат серебра является наиболее широко используемым источником ионов серебра, но сульфат серебра . также используется ^{[ нужна ссылка ]} Золотохлористоводородная кислота обычно используется в качестве источника ионов золота в различных концентрациях (1,0 мМ ^{[ 13 ]} и от 250 до 500 мг ^{[ 17 ]} Au на литр). Синтез наночастиц сульфида кадмия для F. oxysporum проводился с использованием Cd в соотношении 1:1. ²⁺ и ТАК ₄²⁻ в концентрации 1 мМ. ^{[ 20 ]} Наночастицы золота могут различаться по форме и размеру в зависимости от pH раствора ионов. ^{[ 17 ]} Герике и Пинчес (2006) сообщили, что для V. luteoalbum небольшие (около 10 нм) сферические наночастицы золота образуются при pH 3, более крупные (сферические, треугольные, шестиугольные и стержневые) наночастицы золота образуются при pH 5 и при pH 7. до pH 9 крупные наночастицы имеют тенденцию терять определенную форму. Температурные взаимодействия для наночастиц серебра и золота были схожими; более низкая температура привела к образованию более крупных наночастиц, а более высокая температура привела к образованию более мелких наночастиц. ^{[ 17 ]}

Аналитические методы

Визуальные наблюдения

Для наночастиц серебра, синтезированных извне, раствор ионов серебра обычно приобретает коричневатый цвет. ^{[ 7 ]}^{[ 8 ]}^{[ 9 ]} но эта реакция потемнения может отсутствовать. ^{[ нужна ссылка ]} У грибов, синтезирующих внутриклеточные наночастицы серебра, гифы темнеют до коричневатого цвета, а раствор остается прозрачным. В обоих случаях реакция потемнения объясняется поверхностным плазмонным резонансом металлических наночастиц. ^{[ 6 ]}^{[ 21 ]} Для внешнего производства наночастиц золота цвет раствора может варьироваться в зависимости от размера наночастиц золота; более мелкие частицы кажутся розовыми, а крупные частицы кажутся фиолетовыми. Внутриклеточный синтез наночастиц золота обычно окрашивает гифы в фиолетовый цвет, в то время как раствор остается прозрачным. Сообщалось, что внешне синтезированные наночастицы сульфида кадмия делают цвет раствора ярко-желтым. ^{[ 20 ]}

Аналитические инструменты

Сканирующая электронная микроскопия ( SEM ), просвечивающая электронная микроскопия ( TEM ), энергодисперсионный рентгеновский анализ ( EDX ), УФ-видимая спектроскопия и дифракция рентгеновских лучей используются для характеристики различных аспектов наночастиц. И СЭМ, и ПЭМ можно использовать для визуализации местоположения, размера и морфологии наночастиц, а УФ-видимую спектроскопию можно использовать для подтверждения металлической природы, размера и уровня агрегации. Энергодисперсионный рентгеноструктурный анализ применяется для определения элементного состава, а рентгенодифракция — для определения химического состава и кристаллографической структуры. Пики поглощения УФ-Вид наночастиц серебра, золота и сульфида кадмия могут варьироваться в зависимости от размера частиц: пик частиц серебра размером 25–50 нм составляет ок. 415 нм, наночастицы золота 30-40 нм, пик ок. 450 нм, а край поглощения сульфида кадмия ок. 450 указывает на квантовый размер частиц. ^{[ 20 ]} Более крупные наночастицы каждого типа будут иметь пики или края поглощения УФ-ВИД, которые смещаются в сторону более длинных волн, тогда как меньшие наночастицы будут иметь пики или края поглощения УФ-ВИД, которые смещаются в сторону более коротких волн.

Механизмы формирования

Золото и серебро

Было высказано предположение, что нитратредуктаза инициирует образование наночастиц многими грибами, включая виды Penicillium , в то время как несколько ферментов, α-НАДФН-зависимые редуктазы, нитрат-зависимые редуктазы и внеклеточный челночный хинон, участвуют в синтезе наночастиц серебра у Fusarium oxysporum . Джайн и др. (2011) указали, что синтез наночастиц серебра для A. flavus белка (цистеина и свободных аминогрупп), первоначально происходит с помощью белка «33 кДа», за которым следует электростатическое притяжение которое стабилизирует наночастицу путем образования блокирующего агента. ^{[ 11 ]} Внутриклеточный синтез наночастиц серебра и золота до конца не изучен, но было предложено подобное электростатическое притяжение, восстановление и накопление поверхности клеточной стенки грибов. ^{[ 20 ]} Внешний синтез наночастиц золота P. chrysosporium был приписан лакказе , тогда как внутриклеточный синтез наночастиц золота был приписан лигниназе . ^{[ 20 ]}

Сульфид кадмия

Синтез наночастиц сульфида кадмия дрожжами включает секвестрацию Cd. ²⁺ пептидами, родственными глутатиону, с последующим восстановлением внутри клетки. Ахмад и др. (2002) сообщили, что синтез наночастиц сульфида кадмия Fusarium oxysporum основан на сульфатредуктазном (ферментном) процессе.

Ссылки

^ Барредо Дж.Л., изд. (2005). «Микробные клетки и ферменты». Микробные ферменты и биотрансформации . Хумана Пресс. стр. 1–10. ISBN 978-1-58829-253-7 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с Горбани, HR; Сафекорди А.А.; Аттар Х; Резаят Сорхабади С.М. (2011). «Биологические и небиологические методы синтеза наночастиц серебра». Ежеквартальный журнал химической и биохимической инженерии . 25 : 317–326.
^ Перейти обратно: ^а ^б Абу Эль-Нур, ММ; Эфтаиха А; Аль-Вартан А; Аммар РАА (2010). «Синтез и применение наночастиц серебра» . Арабский химический журнал . 3 (3): 135–140. дои : 10.1016/j.arabjc.2010.04.008 .
^ Попеску, М; Веля А; Лоринци А (2010). «Биогенное производство наночастиц». Дайджест J наноматериалов и биоструктур . 5 : 1035–1040.
^ Састри, М; Ахмад А; Хан М.И.; Кумар Р. (2003). «Биосинтез наночастиц металлов с использованием грибов и актиномицетов». Современная наука . 85 : 162–170.
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с Вахаби, К; Мансури Г.А.; Карими С (2011). «Биосинтез наночастиц серебра грибом Trichoderma reesei : путь крупномасштабного производства AgNP» . Журнал наук . 1 : 65–79. дои : 10.5640/insc.010165 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Басавараджа, С; Баладжи С.Д.; Лагашетти А; Раджасаб АХ; Венкатараман А (2008). «Внеклеточный биосинтез наночастиц серебра с использованием гриба Fusarium semitectum ». Бюллетень исследования материалов . 45 (5): 1164–1170. doi : 10.1016/j.materresbull.2007.06.020 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Дуран, Н.; Маркато П.Д.; Алвес О.Л.; IH де Соуза Дж; Эспозито Э (2005). «Механистические аспекты биосинтеза наночастиц серебра несколькими штаммами Fusarium oxysporum » . Журнал нанобиотехнологий . 3 :8. дои : 10.1186/1477-3155-3-8 . ПМЦ 1180851 . ПМИД 16014167 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Навин, Х; Кумар Дж; Картик Л; Роа Б (2010). «Внеклеточный биосинтез наночастиц серебра с использованием нитчатого гриба Penicillium sp». Архивы прикладных научных исследований . 2 : 161–167.
^ Бхайнса, Канзас; Д'Суза СФ (2006). «Внеклеточный биосинтез наночастиц серебра с использованием гриба Aspergillus fumigatas ». Коллоиды и поверхности B: Биоинтерфейсы . 47 (2): 160–164. дои : 10.1016/j.colsurfb.2005.11.026 . ПМИД 16420977 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Джайн, Н.; Джайн Н., Бхаргава А., Маджумдар С., Тарафдар Дж., Панвар Дж.; Маджумдар, Сонали; Тарафдар, JC; Панвар, Джитендра (2011). «Внеклеточный биосинтез и характеристика наночастиц серебра с использованием Aspergillus flavus NJP08: взгляд на механизм». Наномасштаб . 3 (2): 635–641. Бибкод : 2011Nanos...3..635J . дои : 10.1039/c0nr00656d . ПМИД 21088776 . {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
^ Мукерджи, П; Ахмад А., Мандал Д., Сенапати С., Сайнкар С., Хан М., Паришча Р., Аджайкумар П., Алам М., Кумар Р., Састри М.; Мандал, Диндаял; Сенапати, Сатьяджьоти; Сайнкар, Судхакар Р.; Хан, Мохаммед И.; Парища, Рену; Аджайкумар, ПВ; Алам, Мансур; Кумар, Раджив; Састри, Мурали (2001). «Грибково-опосредованный синтез наночастиц серебра и их иммобилизация в мицелиальном матриксе; новый биологический подход к синтезу наночастиц». Нано-буквы . 1 (10): 515–519. Бибкод : 2001NanoL...1..515M . дои : 10.1021/nl0155274 . {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
^ Перейти обратно: ^а ^б Мукерджи, П; Сенапати С; Мандал Д; Ахмад А; Хан М; Кумар Р; Састри М (2002). «Внеклеточный синтез наночастиц золота грибом Fusarium oxysporum ». ХимБиоХим . 3 (5): 461–463. doi : 10.1002/1439-7633(20020503)3:5<461::AID-CBIC461>3.0.CO;2-X . ПМИД 12007181 . S2CID 34520744 .
^ Кастро-Лонгория, Э; Вильчис-Нестор А и Авалес-Борха М; Авалос-Борха, М. (2011). «Биосинтез серебра, золота и биметаллических наночастиц с использованием нитчатого гриба Neurospora crassa ». Коллоиды и поверхности B: Биоинтерфейсы . 83 (1): 42–48. дои : 10.1016/j.colsurfb.2010.10.035 . ПМИД 21087843 .
^ Агнихотри, М; Джоши С; Кумар А; Зиньярде С; Кулкарни С (2009). «Биосинтез наночастиц золота тропическими морскими дрожжами Yarrowia lipolytica NCIM 3589». Материалы писем . 63 (15): 1231–1234. Бибкод : 2009MatL...63.1231A . дои : 10.1016/j.matlet.2009.02.042 .
^ Чаухан, А; Зубайр С; Туфаил С; Шервани А; Саджид М; Раман С; Азам А; Овайс М (2011). «Биологический синтез наночастиц золота, опосредованный грибами: потенциал обнаружения рака печени» . Международный журнал наномедицины . 6 : 2305–2319. дои : 10.2147/ijn.s23195 . ПМК 3205127 . ПМИД 22072868 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д Герике, М; Пинчес А (2006). «Биологический синтез наночастиц металлов». Гидрометаллургия . 83 (1–4): 132–140. Бибкод : 2006HydMe..83..132G . doi : 10.1016/j.гидромет.2006.03.019 .
^ Ли, Х; Сюй Х; Чэнь З; Чен Г (2011). «Биосинтез наночастиц микроорганизмами и их применение» . Журнал наноматериалов . 2011 : 1–16. дои : 10.1155/2011/270974 .
^ Эспиноза-Ортис, Э.Дж.; Гонсалес-Хил Дж; Сайкалы ЧП; ван Халлебуш ЭД; Объектив ПНЛ (2014). «Влияние оксианионов селена на гриб белой гнили Phanerochaete chrysosporium ». Appl Microbiol Biotechnol . 99 (5): 2405–2418. дои : 10.1007/s00253-014-6127-3 . ПМИД 25341399 . S2CID 253768254 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и Ахмад, А; Мукерджи П; Мандал Д; Сенапати С; Хан М; Кумар Р; Састри М (2002). «Фермент-опосредованный внеклеточный синтез наночастиц CdS грибом Fusarium oxysporum ». Журнал Американского химического общества . 124 (41): 12108–12109. дои : 10.1021/ja027296o . ПМИД 12371846 .
^ Шанкар, С; Ахмад А; Састри М (2003). «Биосинтез наночастиц серебра с помощью листьев герани». Биотехнология. Прог . 19 (6): 1627–1631. дои : 10.1021/bp034070w . ПМИД 14656132 . S2CID 10120705 .

[Ref1-1] Барредо Дж.Л., изд. (2005). «Микробные клетки и ферменты». Микробные ферменты и биотрансформации . Хумана Пресс. стр. 1–10. ISBN 978-1-58829-253-7 .

[Ref2-2] Перейти обратно: ^а ^б ^с Горбани, HR; Сафекорди А.А.; Аттар Х; Резаят Сорхабади С.М. (2011). «Биологические и небиологические методы синтеза наночастиц серебра». Ежеквартальный журнал химической и биохимической инженерии . 25 : 317–326.

[Ref3-3] Перейти обратно: ^а ^б Абу Эль-Нур, ММ; Эфтаиха А; Аль-Вартан А; Аммар РАА (2010). «Синтез и применение наночастиц серебра» . Арабский химический журнал . 3 (3): 135–140. дои : 10.1016/j.arabjc.2010.04.008 .

[Ref4-4] Попеску, М; Веля А; Лоринци А (2010). «Биогенное производство наночастиц». Дайджест J наноматериалов и биоструктур . 5 : 1035–1040.

[Ref5-5] Састри, М; Ахмад А; Хан М.И.; Кумар Р. (2003). «Биосинтез наночастиц металлов с использованием грибов и актиномицетов». Современная наука . 85 : 162–170.

[Ref6-6] Перейти обратно: ^а ^б ^с Вахаби, К; Мансури Г.А.; Карими С (2011). «Биосинтез наночастиц серебра грибом Trichoderma reesei : путь крупномасштабного производства AgNP» . Журнал наук . 1 : 65–79. дои : 10.5640/insc.010165 .

[Ref7-7] Перейти обратно: ^а ^б Басавараджа, С; Баладжи С.Д.; Лагашетти А; Раджасаб АХ; Венкатараман А (2008). «Внеклеточный биосинтез наночастиц серебра с использованием гриба Fusarium semitectum ». Бюллетень исследования материалов . 45 (5): 1164–1170. doi : 10.1016/j.materresbull.2007.06.020 .

[Ref8-8] Перейти обратно: ^а ^б Дуран, Н.; Маркато П.Д.; Алвес О.Л.; IH де Соуза Дж; Эспозито Э (2005). «Механистические аспекты биосинтеза наночастиц серебра несколькими штаммами Fusarium oxysporum » . Журнал нанобиотехнологий . 3 :8. дои : 10.1186/1477-3155-3-8 . ПМЦ 1180851 . ПМИД 16014167 .

[Ref9-9] Перейти обратно: ^а ^б Навин, Х; Кумар Дж; Картик Л; Роа Б (2010). «Внеклеточный биосинтез наночастиц серебра с использованием нитчатого гриба Penicillium sp». Архивы прикладных научных исследований . 2 : 161–167.

[Ref12-10] Бхайнса, Канзас; Д'Суза СФ (2006). «Внеклеточный биосинтез наночастиц серебра с использованием гриба Aspergillus fumigatas ». Коллоиды и поверхности B: Биоинтерфейсы . 47 (2): 160–164. дои : 10.1016/j.colsurfb.2005.11.026 . ПМИД 16420977 .

[Ref24-11] Перейти обратно: ^а ^б Джайн, Н.; Джайн Н., Бхаргава А., Маджумдар С., Тарафдар Дж., Панвар Дж.; Маджумдар, Сонали; Тарафдар, JC; Панвар, Джитендра (2011). «Внеклеточный биосинтез и характеристика наночастиц серебра с использованием Aspergillus flavus NJP08: взгляд на механизм». Наномасштаб . 3 (2): 635–641. Бибкод : 2011Nanos...3..635J . дои : 10.1039/c0nr00656d . ПМИД 21088776 . {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )

[Ref13-12] Мукерджи, П; Ахмад А., Мандал Д., Сенапати С., Сайнкар С., Хан М., Паришча Р., Аджайкумар П., Алам М., Кумар Р., Састри М.; Мандал, Диндаял; Сенапати, Сатьяджьоти; Сайнкар, Судхакар Р.; Хан, Мохаммед И.; Парища, Рену; Аджайкумар, ПВ; Алам, Мансур; Кумар, Раджив; Састри, Мурали (2001). «Грибково-опосредованный синтез наночастиц серебра и их иммобилизация в мицелиальном матриксе; новый биологический подход к синтезу наночастиц». Нано-буквы . 1 (10): 515–519. Бибкод : 2001NanoL...1..515M . дои : 10.1021/nl0155274 . {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )

[Ref14-13] Перейти обратно: ^а ^б Мукерджи, П; Сенапати С; Мандал Д; Ахмад А; Хан М; Кумар Р; Састри М (2002). «Внеклеточный синтез наночастиц золота грибом Fusarium oxysporum ». ХимБиоХим . 3 (5): 461–463. doi : 10.1002/1439-7633(20020503)3:5<461::AID-CBIC461>3.0.CO;2-X . ПМИД 12007181 . S2CID 34520744 .

[Ref15-14] Кастро-Лонгория, Э; Вильчис-Нестор А и Авалес-Борха М; Авалос-Борха, М. (2011). «Биосинтез серебра, золота и биметаллических наночастиц с использованием нитчатого гриба Neurospora crassa ». Коллоиды и поверхности B: Биоинтерфейсы . 83 (1): 42–48. дои : 10.1016/j.colsurfb.2010.10.035 . ПМИД 21087843 .

[Ref16-15] Агнихотри, М; Джоши С; Кумар А; Зиньярде С; Кулкарни С (2009). «Биосинтез наночастиц золота тропическими морскими дрожжами Yarrowia lipolytica NCIM 3589». Материалы писем . 63 (15): 1231–1234. Бибкод : 2009MatL...63.1231A . дои : 10.1016/j.matlet.2009.02.042 .

[Ref17-16] Чаухан, А; Зубайр С; Туфаил С; Шервани А; Саджид М; Раман С; Азам А; Овайс М (2011). «Биологический синтез наночастиц золота, опосредованный грибами: потенциал обнаружения рака печени» . Международный журнал наномедицины . 6 : 2305–2319. дои : 10.2147/ijn.s23195 . ПМК 3205127 . ПМИД 22072868 .

[Ref18-17] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д Герике, М; Пинчес А (2006). «Биологический синтез наночастиц металлов». Гидрометаллургия . 83 (1–4): 132–140. Бибкод : 2006HydMe..83..132G . doi : 10.1016/j.гидромет.2006.03.019 .

[Ref20-18] Ли, Х; Сюй Х; Чэнь З; Чен Г (2011). «Биосинтез наночастиц микроорганизмами и их применение» . Журнал наноматериалов . 2011 : 1–16. дои : 10.1155/2011/270974 .

[Ref25-19] Эспиноза-Ортис, Э.Дж.; Гонсалес-Хил Дж; Сайкалы ЧП; ван Халлебуш ЭД; Объектив ПНЛ (2014). «Влияние оксианионов селена на гриб белой гнили Phanerochaete chrysosporium ». Appl Microbiol Biotechnol . 99 (5): 2405–2418. дои : 10.1007/s00253-014-6127-3 . ПМИД 25341399 . S2CID 253768254 .

[Ref21-20] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и Ахмад, А; Мукерджи П; Мандал Д; Сенапати С; Хан М; Кумар Р; Састри М (2002). «Фермент-опосредованный внеклеточный синтез наночастиц CdS грибом Fusarium oxysporum ». Журнал Американского химического общества . 124 (41): 12108–12109. дои : 10.1021/ja027296o . ПМИД 12371846 .

[Ref23-21] Шанкар, С; Ахмад А; Састри М (2003). «Биосинтез наночастиц серебра с помощью листьев герани». Биотехнология. Прог . 19 (6): 1627–1631. дои : 10.1021/bp034070w . ПМИД 14656132 . S2CID 10120705 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]

[ 15 ]

[ 16 ]

[ 17 ]

[ 18 ]

[ 19 ]

[ 20 ]

[ 21 ]