Одночастичная траектория

Одночастичные траектории ( ОПТ ) состоят из набора последовательных дискретных точек, причинно-следственных во времени. Эти траектории получены из изображений экспериментальных данных. В контексте клеточной биологии траектории получаются путем временной активации лазером небольших красителей, прикрепленных к движущейся молекуле.

Молекулы теперь можно визуализировать с помощью новейшей микроскопии сверхвысокого разрешения , которая позволяет рутинно собирать тысячи коротких и длинных траекторий. Эти траектории исследуют часть клетки либо на мембране, либо в трех измерениях, и на их пути критически влияют локальная скученная организация и молекулярное взаимодействие внутри клетки. как подчеркивается в различных типах клеток, таких как нейрональные клетки, астроциты , иммунные клетки и многие другие.

СПП позволяют наблюдать за перемещением молекул внутри клеток для сбора статистики

СПП позволил наблюдать движущиеся частицы. Эти траектории используются для исследования организации цитоплазмы или мембраны. но также динамика клеточного ядра, динамика ремоделирования или выработка мРНК. Из-за постоянного совершенствования аппаратуры пространственное разрешение постоянно снижается, достигая сейчас значений примерно 20 нм, тогда как шаг времени сбора данных обычно находится в диапазоне от 10 до 50 мс для фиксации коротких событий, происходящих в живых тканях. Вариант микроскопии сверхвысокого разрешения, называемый sptPALM, используется для обнаружения локальной и динамически изменяющейся организации молекул в клетках или событий связывания ДНК факторами транскрипции в ядрах млекопитающих. Получение изображений сверхвысокого разрешения и отслеживание частиц имеют решающее значение для обеспечения высококачественных данных.

Сборка точек в траекторию на основе алгоритмов отслеживания

После получения точек следующим шагом будет восстановление траектории. Этот шаг выполняется известными алгоритмами отслеживания для соединения полученных точек. Алгоритмы слежения основаны на физической модели траекторий, возмущенных аддитивным случайным шумом.

Извлечение физических параметров из резервных SPT

Избыточность многих коротких значений (SPT) является ключевой особенностью извлечения параметров биофизической информации из эмпирических данных на молекулярном уровне. Напротив, длинные изолированные траектории использовались для извлечения информации по траекториям, разрушая естественную пространственную неоднородность, связанную с различными позициями. Основным статистическим инструментом является вычисление среднеквадратического смещения (MSD) или статистического момента второго порядка :

$\langle |X(t+\Delta t)-X(t)|^{2}\rangle \sim t^{\alpha }$ (среднее по реализациям ), где $\alpha$ называется аномальным показателем .

Для броуновского движения $\langle |X(t+\Delta t)-X(t)|^{2}\rangle =2nDt$, где D — коэффициент диффузии, n — размерность пространства. Некоторые другие свойства также можно восстановить по длинным траекториям, например, радиус ограничения ограниченного движения. MSD широко использовался в ранних приложениях длинных, но не обязательно избыточных траекторий одиночных частиц в биологическом контексте. Однако MSD, применяемый к длинным траекториям, имеет несколько проблем. Во-первых, это неточно отчасти потому, что измеренные точки могут быть коррелированы. Во-вторых, его нельзя использовать для вычисления какого-либо физического коэффициента диффузии, когда траектории состоят из эпизодов переключения, например, чередования свободной и ограниченной диффузии. При низком пространственно-временном разрешении наблюдаемых траекторий МСД ведет себя сублинейно со временем - процесс, известный как аномальная диффузия, который частично обусловлен усреднением различных фаз движения частицы. В контексте клеточного транспорта (амеобоид) анализ движения длинных SPT с высоким разрешением. в микрофлюидных камерах, содержащих препятствия, выявлены различные типы движений клеток. В зависимости от плотности препятствий: при малой плотности препятствий обнаружено ползание, можно даже дифференцировать направленное движение и случайные фазы.

Физическая модель для восстановления пространственных свойств из резервных SPT

Уравнения Ланжевена и Смолуховского как модель движения

Статистические методы извлечения информации из SPT основаны на стохастических моделях, таких как уравнение Ланжевена или его предел Смолуховского и связанных с ним моделях, которые учитывают дополнительный шум идентификации точки локализации или ядро ​​памяти. Уравнение Ланжевена описывает стохастическую частицу, движимую броуновской силой. $\Xi$ и силовое поле (например, электростатическое, механическое и т. д.) с выражением $F(x,t)$:

$m{\ddot {x}}+\Gamma {\dot {x}}-F(x,t)=\Xi ,$

где m - масса частицы и $\Gamma =6\pi a\rho$– коэффициент трения диффундирующей частицы, $\rho$ вязкость ​ . Здесь $\Xi$ это $\delta$-коррелированный гауссов белый шум. Сила может быть получена из потенциальной ямы U так, что $F(x,t)=-U'(x)$ и в этом случае уравнение принимает вид

$m{\frac {d^{2}x}{dt^{2}}}+\Gamma {\frac {dx}{dt}}+\nabla U(x)={\sqrt {2\varepsilon \gamma }}\,{\frac {d\eta }{dt}},$

где $\varepsilon =k_{\text{B}}T,$ это энергия и $k_{\text{B}}$ и постоянная Больцмана T температура . Уравнение Ланжевена используется для описания траекторий, где важна инерция или ускорение. Например, в очень короткие сроки, когда молекула отрывается от места связывания или выходит из потенциальной ямы. а член инерции позволяет частицам удаляться от аттрактора и, таким образом, предотвращает немедленное повторное связывание, которое может помешать численному моделированию.

В пределе большого трения $\gamma \to \infty$ траектории $x(t)$ уравнения Ланжевена сходится по вероятности к уравнениям Смолуховского

$\gamma {\dot {x}}+U^{\prime }(x)={\sqrt {2\varepsilon \gamma }}\,{\dot {w}},$

где ${\dot {w}}(t)$ является $\delta$- коррелирует. Это уравнение получается, когда коэффициент диффузии постоянен в пространстве. Если это не так, крупнозернистые уравнения (с грубым пространственным разрешением) следует выводить из молекулярных соображений. Интерпретация физических сил не решается интегральными представлениями Ито и Стратоновича или какими-либо другими.

Общие уравнения модели

Для временных масштабов, намного больших, чем элементарное молекулярное столкновение, положение частицы, сопровождаемой треком, описывается более общим пределом перезатухания стохастической модели Ланжевена. Действительно, если временной масштаб регистрации эмпирически зарегистрированных траекторий намного меньше по сравнению с тепловыми флуктуациями, быстрые события не разрешаются в данных. Таким образом, в этом более грубом пространственно-временном масштабе описание движения заменяется эффективным стохастическим уравнением.

${\dot {X}}(t)={b}(X(t))+{\sqrt {2}}{B}_{e}(X(t)){\dot {w}}(t),\qquad \qquad (1)$

где ${b}(X)$ поле дрейфа и ${B}_{e}$диффузионная матрица. Тензор эффективной диффузии может меняться в пространстве $D(X)={\frac {1}{2}}B(X)B^{T}X^{T}$ ( ${\textstyle X^{T}}$ обозначает транспонирование ${\textstyle X}$). Это уравнение не выведено, а предполагается. Однако коэффициент диффузии должен быть достаточно гладким, поскольку любой разрыв в D должен быть устранен путем пространственного масштабирования для анализа источника разрыва (обычно инертные препятствия или переходы между двумя средами). Наблюдаемый эффективный тензор диффузии не обязательно изотропен и может зависеть от состояния, тогда как коэффициент трения $\gamma$ остается постоянным до тех пор, пока среда остается прежней и микроскопический коэффициент диффузии (или тензор) может оставаться изотропным.

Статистический анализ этих траекторий

Разработка статистических методов основана на стохастических моделях, возможной процедуре деконволюции, применяемой к траекториям. Численное моделирование также можно использовать для выявления конкретных особенностей, которые можно извлечь из данных о траекториях одиночных частиц. Целью создания статистического ансамбля на основе данных SPT является наблюдение локальных физических свойств частиц, таких как скорость, диффузия, удержание или силы притяжения, отражающие взаимодействие частиц с их локальной нанометровой средой. Можно использовать стохастическое моделирование, чтобы построить из коэффициента диффузии (или тензора) конфайнмент или локальную плотность препятствий, отражающую наличие биологических объектов разных размеров.

Эмпирические оценки тензора сноса и диффузии случайного процесса

Было предложено несколько эмпирических оценок для восстановления локального коэффициента диффузии, векторного поля и даже организованных закономерностей дрейфа, таких как потенциальные ямы. Построение эмпирических оценок, которые служат для восстановления физических свойств на основе параметрической и непараметрической статистики. Для извлечения статистических параметров процесса диффузии из статистики одномерных временных рядов используется оценка первого момента или байесовский вывод.

Модели и анализ предполагают, что процессы стационарны, так что статистические свойства траекторий не меняются со временем. На практике это предположение выполняется, когда траектории регистрируются менее чем за минуту, когда, например, на поверхности нейрона может произойти лишь несколько медленных изменений. Нестационарное поведение наблюдают с помощью покадрового анализа с задержкой в ​​десятки минут между последовательными измерениями.

Грубозернистая модель (уравнение). 1 восстанавливается из условных моментов траектории путем вычисления приращений $\Delta X=X(t+\Delta t)-X(t)$:

$a(x)=\lim _{\Delta t\rightarrow 0}{\frac {E[\Delta X(t)\mid X(t)=x]}{\Delta t}},$

$D(x)=\lim _{\Delta t\rightarrow 0}{\frac {E[\Delta X(t)^{T}\,\Delta X(t)\mid X(t)=x]}{2\,\Delta t}}.$

Здесь обозначения $E[\cdot \,|\,X(t)=x]$означает усреднение по всем траекториям, которые находятся в точке x в момент времени t . Коэффициенты уравнения Смолуховского можно статистически оценить в каждой точке x по бесконечно большой выборке ее траекторий в окрестности точки x в момент времени t .

Эмпирическая оценка

На практике ожидания для a и D оцениваются конечными выборочными средними и $\Delta t$ - временное разрешение записанных траекторий. Формулы для a и D аппроксимируются на шаге по времени $\Delta t$, где десятки и сотни точек попадают в любую корзину. Обычно этого достаточно для оценки.

Чтобы оценить локальные коэффициенты дрейфа и диффузии, траектории сначала группируются в пределах небольшой окрестности. Поле наблюдения разделено на квадратные ячейки. $S(x_{k},r)$стороны r и центра $x_{k}$ и локальный дрейф и диффузия оцениваются для каждого квадрата. Рассматривая образец с $N_{t}$ траектории $\{x^{i}(t_{1}),\dots ,x^{i}(t_{N_{s}})\},$ где $t_{j}$ — время выборки, дискретизация уравнения дрейфа $a(x_{k})=(a_{x}(x_{k}),a_{y}(x_{k}))$на позиции $x_{k}$ дается для каждой пространственной проекции на оси x и y выражением

$a_{x}(x_{k})\approx {\frac {1}{N_{k}}}\sum _{j=1}^{N_{t}}\sum _{i=0,{\tilde {x}}_{i}^{j}\in S(x_{k},r)}^{N_{s}-1}\left({\frac {x_{i+1}^{j}-x_{i}^{j}}{\Delta t}}\right)$

$a_{y}(x_{k})\approx {\frac {1}{N_{k}}}\sum _{j=1}^{N_{t}}\sum _{i=0,{\tilde {x}}_{i}^{j}\in S(x_{k},r)}^{N_{s}-1}\left({\frac {y_{i+1}^{j}-y_{i}^{j}}{\Delta t}}\right),$

где $N_{k}$- количество точек траектории, попадающих в квадрат $S(x_{k},r)$. Аналогично компоненты тензора эффективной диффузии $D(x_{k})$ аппроксимируются эмпирическими суммами

$D_{xx}(x_{k})\approx {\frac {1}{N_{k}}}\sum _{j=1}^{N_{t}}\sum _{i=0,x_{i}\in S(x_{k},r)}^{N_{s}-1}{\frac {(x_{i+1}^{j}-x_{i}^{j})^{2}}{2\,\Delta t}},$

$D_{yy}(x_{k})\approx {\frac {1}{N_{k}}}\sum _{j=1}^{N_{t}}\sum _{i=0,x_{i}\in S(x_{k},r)}^{N_{s}-1}{\frac {(y_{i+1}^{j}-y_{i}^{j})^{2}}{2\,\Delta t}},$

$D_{xy}(x_{k})\approx {\frac {1}{N_{k}}}\sum _{j=1}^{N_{t}}\sum _{i=0,x_{i}\in S(x_{k},r)}^{N_{s}-1}{\frac {(x_{i+1}^{j}-x_{i}^{j})(y_{i+1}^{j}-y_{i}^{j})}{2\,\Delta t}}.$

Для оценки момента требуется большое количество траекторий, проходящих через каждую точку, что точно согласуется с огромными данными, генерируемыми с помощью определенных типов данных сверхразрешения, например, полученных с помощью метода sptPALM на биологических образцах. Точное обращение уравнения Лаженвена теоретически требует бесконечного числа траекторий, проходящих через любую интересующую точку x. На практике восстановление тензора дрейфа и диффузии достигается после разделения области квадратной сеткой радиуса r или перемещением скользящих окон (порядка 50–100 нм).

Автоматизированное восстановление границы нанодомена

Алгоритмы, основанные на картировании плотности точек, извлеченных из траекторий, позволяют выявить локальные взаимодействия связывания и трафика, а также организацию динамических субклеточных сайтов. Алгоритмы могут быть применены для исследования областей высокой плотности, выявляемых с помощью СПД. Примерами являются органеллы, такие как эндоплазматическая сеть или клеточные мембраны. Метод основан на пространственно-временной сегментации для обнаружения локальной архитектуры и границ областей с высокой плотностью для доменов размером в сотни нанометров.