Jump to content

Деградомное секвенирование

Деградомное секвенирование (Degradome-Seq), [ 1 ] [ 2 ] Также называемый параллельным анализом концов РНК (PARE) — это модифицированная версия 5'- быстрой амплификации концов кДНК (RACE) с использованием высокопроизводительных методов глубокого секвенирования, таких как технология SBS компании Illumina . Деградом охватывает весь набор протеаз , которые экспрессируются в определенное время в данном биологическом материале, включая ткани, клетки, организмы и биожидкости. [ 3 ] Таким образом, секвенирование этого деградома предлагает метод изучения и исследования процесса деградации РНК. Этот процесс используется для идентификации и количественного определения продуктов или фрагментов деградации РНК, присутствующих в любом биологическом образце. [ 4 ] Этот подход позволяет систематически идентифицировать мишени распада РНК и дает представление о динамике транскрипционной и посттранскрипционной регуляции генов. [ 4 ]

Секвенирование деградома — это сложный процесс, включающий несколько этапов, таких как выделение фрагментов РНК в данном образце, а также лигирование и обратная транскрипция с образованием нитей комплементарной ДНК ( кДНК ). [ 4 ] Эту кДНК можно секвенировать, а результаты сравнивать с транскриптомом или эталонным геномом, чтобы определить и охарактеризовать количество фрагментов РНК, идентифицированных в этом процессе. [ 4 ]

Схема методологии секвенирования деградома и построения улучшенной библиотеки деградома посредством расщепления, индуцированного микроРНК, обратной транскрипции, синтеза второй цепи, ПЦР, а также объединения образцов и секвенирования.

В целом основные шаги, необходимые для секвенирования деградома, включают:

  1. Выделение и разделение РНК: РНК выделяют из образца и фракционируют по размеру для разделения и классификации малых молекул РНК. [ 5 ]
  2. Секвенирование библиотеки: затем РНК лигируют и используют для формирования цепей кДНК посредством обратной транскрипции . Затем кДНК денатурируется и реплицируется с помощью полимеразной цепной реакции ( ПЦР ). В результате получается библиотека, созданная и секвенированная с использованием высокопроизводительных методов глубокого секвенирования. [ 5 ]
  3. Анализ данных: последовательности, полученные в результате этих процедур, обрабатываются с использованием инструментов биоинформатики для удаления результатов низкого качества, последовательностей, которые являются адаптерами, и других форм нежизнеспособных результатов. [ 5 ] После этого этапа скрининга оставшиеся прочтения сравниваются с эталонным геномом (транскриптомом) для определения сайтов расщепления и их конкретного местоположения. [ 5 ]
  4. Анализ сайтов расщепления. Сайты расщепления анализируются для идентификации целевых транскриптов фермента, расщепляющего РНК. [ 5 ] Сайты расщепления идентифицируются в 3'-нетранслируемой области ( UTR ) мРНК. Кроме того, мотивы последовательности и другие мишени, участвующие в деградации, опосредованной микроРНК. с помощью анализа сайтов расщепления можно идентифицировать [ 5 ]

Анализ секвенированных необработанных данных

[ редактировать ]

При анализе необработанных данных, полученных в результате секвенирования деградома, для исследователей полезны такие программные инструменты, как CleaveLand, PAREsnip и miRferno. [ 6 ]

Методика анализа данных CleaveLand

[ редактировать ]

Данные секвенирования деградома и структурные РНК используются для удаления всех последовательностей деградома, точно соответствующих структурным РНК. Затем база данных кДНК используется для сопоставления последовательностей деградома с последовательностями кДНК. Последовательности деградома со многими совпадениями транскриптома нормализуются. Затем генерируются последовательности запроса мРНК для соответствующей последовательности деградома. Эти последовательности запроса сопоставляются с малыми РНК , и выполняется поиск комплементарности, чтобы сопоставить последовательности запроса с малыми РНК. Затем выдается сигнал для запуска анализа шума, который помогает отличить ложные результаты от реальных целей. Наконец, результат анализа данных включает в себя список всех целей мРНК с соответствующими выравниваниями для пар малых РНК-мРНК. [ 7 ]

Приложения

[ редактировать ]

Введение

[ редактировать ]
Это изображение демонстрирует сложность данных деградомного секвенирования при использовании для применения повторной аннотации микроРНК. Секвенирование деградома позволило идентифицировать зрелые микроРНК, выделенные зеленым цветом, и сайты процессинга, поддерживаемые сигналами деградома, обозначенные стрелками на предсказанной вторичной структуре предшественника микроРНК.

Приложения деградомного секвенирования включают идентификацию мишеней микроРНК (миРНК), установление методов распада мРНК и поиск новых некодирующих фрагментов РНК. В частности, этот инструмент использовался для определения целей микроРНК во многих организмах, таких как растения. [ 8 ] и млекопитающие. [ 9 ] Секвенирование деградома также использовалось для изучения роли путей распада РНК при раке. [ 9 ] и идентифицировать новые типы некодирующих РНК. [ 8 ]

В конечном счете, деградомное секвенирование — мощный инструмент для всестороннего анализа деградации РНК, имеющий множество применений в биологических исследованиях, а также в медицине.

Исследование микроРНК

[ редактировать ]

МикроРНК представляют собой класс малых некодирующих РНК, созданных путем удаления предшественников «стебель-петля» . [ 10 ] МикроРНК играют роль в контроле экспрессии генов посттранскрипционно, а также во время транскрипции посредством подавления РНК. [ 11 ] Для этого РНК-индуцированный комплекс молчания ( RISC ) преобразует пре-микроРНК в зрелые микроРНК. [ 12 ] Зрелые микроРНК нацелены на определенные виды мРНК для регуляции, часто через комплекс RISC, разбирающий определенные последовательности мРНК для ингибирования трансляции . [ 12 ]

МикроРНК высококонсервативны у многих видов, поэтому деградомное секвенирование используется в исследованиях для идентификации мишеней мРНК у многих видов. [ 13 ] Секвенирование деградома использовалось для идентификации сайтов расщепления микроРНК. [ 13 ] потому что микроРНК могут вызывать эндонуклеолитическое расщепление мРНК за счет обширной и часто идеальной комплементарности мРНК. [ 1 ] [ 2 ] Секвенирование деградома выявило множество известных и новых мишеней растительных микроРНК и малых интерферирующих РНК ( миРНК ). [ 1 ] [ 2 ] [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] Недавно деградомное секвенирование также было применено для идентификации расщеплений микроРНК животных (человека и мыши). [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ]

Отслеживание сигналов обработки микроРНК с помощью анализа данных деградомного секвенирования

[ редактировать ]
Новая модель, предложенная для процессинга микроРНК, включающая механизмы «основание-петля» и «петля-основание», основана на обильных данных о распределении, полученных с помощью деградомного секвенирования.

В этом исследовании исследователи отслеживали и сообщали о промежуточных продуктах процессинга микроРНК. Сигналы деградома на предшественниках микроРНК были извлечены и обработаны для 15 различных видов. Использование деградомного секвенирования в этом исследовании позволило собрать данные, которые поддержали анализ и обработку многих предшественников микроРНК, с большим соотношением микроРНК с высокой достоверностью, аннотированных в miRBase , базе данных микроРНК, чем те, которые считаются низкодостоверными. Кроме того, это исследование подчеркнуло важность деградомного секвенирования как метода изучения аннотации микроРНК. В частности, распределение сигнала обработки, полученное с помощью данных деградомного секвенирования, позволило исследователям предложить новую модель метода нарезки микроРНК и определить частоту, с которой происходит режим обработки «петля к основанию». В конечном счете, результаты этого исследования указывают на впечатляющую способность данных деградомного секвенирования отслеживать сигналы обработки микроРНК, обеспечивая новое понимание процессинга и функции микроРНК. [ 21 ]

Деградом РНК: ценный ресурс для расшифровки кодов процессинга и регуляции РНК у растений

[ редактировать ]

В этом исследовании исследователи разработали модель, в которой биологи могли бы использовать данные, полученные в результате секвенирования деградома, для определения влияния транскрипционной и/или посттранскрипционной регуляции на закономерности экспрессии генов в растениях. В частности, эта модель применяет данные деградомного секвенирования, чтобы установить метод, с помощью которого малые РНК (мРНК) созревают и направляют процесс целевой регуляции генов. Результаты этого исследования демонстрируют обширные потенциальные возможности применения анализа секвенирования деградома в будущих исследованиях биологии РНК у эукариот . В частности, данные деградомного секвенирования можно использовать для отслеживания сигналов обработки некодирующей РНК ( нкРНК ), что станет ценным инструментом, если его расширить и включить в него исследования на животных. [ 8 ]

[ редактировать ]
  • База данных starBase : база данных для изучения сайтов расщепления микроРНК на основе данных деградомного секвенирования (Degradome-Seq) .

Исследования рака

[ редактировать ]

Деградомное секвенирование можно использовать для идентификации сайтов расщепления РНК путем секвенирования 5'-конца расщепленных фрагментов РНК. [ 4 ] Этот метод широко использовался в исследованиях рака для выявления потенциальных мишеней ферментов, расщепляющих РНК, участвующих в прогрессировании рака. Таким образом, деградомное секвенирование предоставило новый метод обнаружения маркеров для ранней диагностики и определения прогноза у онкологических больных. Учитывая установленную роль внеклеточных протеаз в стимулировании развития и роста опухолей в различных тканях, секвенирование деградома также имеет важное значение для открытия новых терапевтических мишеней для лечения рака. [ 22 ]

Генерация двух фенотипически различных клеточных линий рака молочной железы у мышей, каждая из которых является мишенью деградомов. Таким образом, деградомное секвенирование использовалось для идентификации и различия протеаз, важных для роста клеток рака молочной железы (А), и протеаз, важных только в определенных условиях окружающей среды (Б).

Скрининг деградом-ориентированной РНК-интерференции для идентификации протеаз, важных для роста клеток рака молочной железы

[ редактировать ]

В этом исследовании исследователи использовали деградомное секвенирование для анализа всех кодируемых геномом протеаз, участвующих в росте клеток, связанном с раком молочной железы. Этот генетический скрининг был проведен на двух линиях клеток рака молочной железы у мышей, которые фенотипически различались. Одним из них была линия клеток рака молочной железы, подобная стволовым клеткам, которая меняла свое поведение в различных условиях окружающей среды, таких как доступность кислорода и питательных веществ. Секвенирование деградома с последующим многоэтапным процессом отбора выявило 100 генов протеаз, которые играют роль в росте клеток рака молочной железы. Хотя роль многих из этих генов протеаз в росте рака молочной железы была подтверждена предыдущими исследованиями, это исследование обнаружило, что некоторые ранее неизвестные протеазы участвуют в росте рака. Кроме того, это исследование показало, что факторы окружающей среды, такие как содержание питательных веществ и кислорода, влияют на степень, в которой клетки рака молочной железы полагаются на специфические протеазы, идентифицированные с помощью деградомного секвенирования. [ 9 ]

Результаты этого исследования были подтверждены с использованием индивидуальных нокдаун-конструкций на мышах, которые функционально уменьшали интересующие протеазы и влияли на экспрессию клеток рака молочной железы. Эти результаты указывают на высокую степень надежности секвенирования деградома при идентификации протеаз, участвующих в росте клеточных линий рака молочной железы на мышиных моделях. В конечном итоге это исследование пришло к выводу, что секвенирование деградома является полезным исследовательским инструментом для обнаружения и анализа функций протеаз в пролиферации рака молочной железы. Это имеет много важных последствий для потенциального секвенирования деградома в качестве диагностического инструмента при раннем выявлении и лечении рака молочной железы. [ 9 ]

  1. ^ Jump up to: а б с Герман М.А., Пиллэй М., Чон Д.Х., Хетавал А., Луо С., Джанарданан П., Каннан В., Римаркис Л.А., Нобута К., Герман Р., Де Паоли Э., Лу К., Шрот Г., Мейерс Б.С., Грин П.Дж. (2008). «Глобальная идентификация пар микроРНК-РНК-мишень путем параллельного анализа концов РНК». Нат. Биотехнология . 26 (8): 941–946. дои : 10.1038/nbt1417 . ПМИД   18542052 . S2CID   13187064 .
  2. ^ Jump up to: а б с Аддо-Квай С., Эшу Т.В., Бартел Д.П., Экстелл М.Дж. (2008). «Эндогенные мишени миРНК и микроРНК, идентифицированные путем секвенирования деградома Arabidopsis» . Курс. Биол . 18 (10): 758–762. Бибкод : 2008CBio...18..758A . дои : 10.1016/j.cub.2008.04.042 . ПМК   2583427 . ПМИД   18472421 .
  3. ^ ТРИНДАДЕ, Фабио; ФЕРРЕЙРА, Рита; АМАДО, Франциско; Виторино, Руи (01 января 2015 г.), Маковски, Грегори С. (редактор), «Глава пятая - Профилирование протеаз биожидкости при сахарном диабете» , «Достижения в клинической химии» , 69 , Elsevier: 161–207, doi : 10.1016/ bs.acc.2014.12.004 , PMID   25934362 , получено 17 апреля 2023 г.
  4. ^ Jump up to: а б с д и Линь, Ши-Шун; Чен, Ихуа; Лу, Мэй-Йе Джейд (2019). «Секвенирование деградома у растений» . Растительные микроРНК . Методы молекулярной биологии. Том. 1932. стр. 197–213. дои : 10.1007/978-1-4939-9042-9_15 . ISBN  978-1-4939-9041-2 . ISSN   1940-6029 . ПМИД   30701502 . S2CID   73413403 .
  5. ^ Jump up to: а б с д и ж Ли, Юн-Фан; Ван, Мэнглей; Ван, Цзе, Цзэн, Юн; Сункар, Раманджулу (2019-11-18) . «Создание библиотеки деградомов, подходящей для секвенирования с использованием платформы Illumina» 1 15 ( ) : 134. doi : 10.1186 s13007-019-0524-7 ISSN   1746-4811 . PMC   6859640 /  
  6. ^ Фолкс, Лейтон; Моксон, Саймон; Вулфенден, Хью К.; Стокс, Мэтью Б.; Шиття, Дьёрдь; Далмей, Тамас; Моултон, Винсент (1 июля 2012 г.). «PAREsnip: инструмент для быстрого полногеномного обнаружения взаимодействий малых РНК и мишени, подтвержденных с помощью деградомного секвенирования» . Исследования нуклеиновых кислот . 40 (13): е103. дои : 10.1093/nar/gks277 . ISSN   1362-4962 . ПМК   3401462 . ПМИД   22467211 .
  7. ^ Аддо-Квай, Чарльз; Миллер, Уэбб; Экстелл, Майкл Дж. (1 января 2009 г.). «CleaveLand: конвейер для использования данных деградома для поиска расщепленных малых РНК-мишеней» . Биоинформатика . 25 (1): 130–131. doi : 10.1093/биоинформатика/btn604 . ISSN   1367-4803 . ПМК   3202307 . ПМИД   19017659 .
  8. ^ Jump up to: а б с Ма, Сяося; Инь, Сяопу; Тан, Чжунхай; Ито, Хидетака; Шао, Чаоган; Мэн, Ицзюнь; Се, Тянь (2020). «Деградом РНК: ценный ресурс для расшифровки кодов процессинга и регуляции РНК у растений» . Биология РНК . 17 (9): 1223–1227. дои : 10.1080/15476286.2020.1757898 . ISSN   1547-6286 . ПМК   7549650 . ПМИД   32338184 .
  9. ^ Jump up to: а б с д Хельцен, Лена; Сире, Керстин; Митшке, Ян; Браммер, Тилман; Митинг, Корнелиус; Райнхекель, Томас (12 октября 2022 г.). «Скрининг РНК-интерференции, ориентированный на деградом, для выявления протеаз, важных для роста клеток рака молочной железы» . Границы онкологии . 12 : 960109. doi : 10.3389/fonc.2022.960109 . ISSN   2234-943X . ПМЦ   9598039 . ПМИД   36313646 .
  10. ^ Цуй, Хуачунь; Се, На; Тан, Чжэн; Банерджи, Сами; Танникал, Виктор; Авраам, Эдвард; Лю, Банда (июль 2014 г.). «Длинная некодирующая РНК человека lnc-IL7R регулирует воспалительную реакцию» . Европейский журнал иммунологии . 7 (44): 2084–2095. дои : 10.1002/eji.201344126 . ПМК   4107034 . ПМИД   24723426 .
  11. ^ Цао, Чуньюй; Конг, Сянцзюнь; Фэн, Гуандэ; Чэнь, Лун; Чу, Минсин; Ван, Чжан, Баоюнь; «Репродуктивная роль микроРНК в гипоталамо- » оси 88 гипофизарной : 130–137. doi : 10.1016/ . ISSN   1044-7431 . PMID   29414103. j.mcn.2018.01.008 S2CID   24050423 .
  12. ^ Jump up to: а б Редферн, Эндрю Д.; Колли, Шейн М.; Беверидж, Дайан Дж.; Икеда, Наоя; Эпис, Майкл Р.; Ли, Ся; Фулдс, Чарльз Э.; Стюарт, Лиза М.; Баркер, Эндрю; Рассел, Виктория Дж.; Рамзи, Керри; Кобельке, Саймон Дж.; Ли, Сяотао; Хэтчелл, Эсме К.; Пейн, Кристина (16 апреля 2013 г.). «РНК-индуцированный комплекс молчания (RISC) Белки PACT, TRBP и Dicer являются корегуляторами ядерных рецепторов, связывающих SRA» . Труды Национальной академии наук . 110 (16): 6536–6541. Бибкод : 2013PNAS..110.6536R . дои : 10.1073/pnas.1301620110 . ISSN   0027-8424 . ПМЦ   3631673 . ПМИД   23550157 .
  13. ^ Jump up to: а б Томсон, Д.В.; Бракен, CP; Гудолл, Дж.Дж. (7 июня 2011 г.). «Экспериментальные стратегии идентификации мишеней микроРНК» . Исследования нуклеиновых кислот . 39 (16): 6845–6853. дои : 10.1093/nar/gkr330 . ПМК   3167600 . ПМИД   21652644 .
  14. ^ Ян Дж.Х., Ли Дж.Х., Шао П., Чжоу Х., Чен Ю.К., Цюй Л.Х. (2011). «starBase: база данных для изучения карт взаимодействия микроРНК-мРНК на основе данных Argonaute CLIP-Seq и Degradome-Seq» . Нуклеиновые кислоты Рез . 39 (Проблема с базой данных): 1–8. дои : 10.1093/нар/gkq1056 . ПМК   3013664 . ПМИД   21037263 .
  15. ^ Хендерсон, ИК; Якобсен, SE (2008). «Секвенирование срезанных концов выявляет мишени микроРНК» . Природная биотехнология . 26 (8): 881–882. дои : 10.1038/nbt0808-881 . ПМЦ   2989925 . ПМИД   18688239 .
  16. ^ Ву, Л.; Чжан, К.; Чжоу, Х.; Ни, Ф.; Ву, Х.; Ци, Ю. (2009). «Эффекторные комплексы и мишени рисовой микроРНК» . Растительная клетка онлайн . 21 (11): 3421–35. дои : 10.1105/tpc.109.070938 . ПМЦ   2798332 . ПМИД   19903869 .
  17. ^ Панталео, В.; Ситтия, Г.; Моксон, С.; Миоцци, Л.; Моултон, В.; Далмей, Т.; Бургян, Дж. (2010). «Идентификация микроРНК виноградной лозы и их мишеней с использованием высокопроизводительного секвенирования и анализа деградома». Заводской журнал . 62 (6): 960–76. дои : 10.1111/j.0960-7412.2010.04208.x . ПМИД   20230504 .
  18. ^ Шин, К.; Нам, Дж.В.; Фарх, КХ; Чан, HR; Шкуматава, А.; Бартель, ДП (2010). «Расширение кода нацеливания микроРНК: функциональные сайты с центрированным спариванием» . Молекулярная клетка . 38 (6): 789–802. doi : 10.1016/j.molcel.2010.06.005 . ПМЦ   2942757 . ПМИД   20620952 .
  19. ^ Каргинов Ф.В.; Челуфи, С.; Чонг, MMW; Старк, А.; Смит, AD; Хэннон, Дж.Дж. (2010). «Различные сайты эндонуклеолитического расщепления в транскриптоме млекопитающих зависят от микроРНК, дроши и дополнительных нуклеаз» . Молекулярная клетка . 38 (6): 781–8. doi : 10.1016/j.molcel.2010.06.001 . ПМЦ   2914474 . ПМИД   20620951 .
  20. ^ Бракен, CP; Шуберт, Дж. М.; Мерсер, ТР; Динджер, Мэн; Томсон, Д.В.; Мэттик, Дж.С.; Майкл, МЗ; Гудолл, Дж.Дж. (22 марта 2011 г.). «Глобальный анализ деградома РНК млекопитающих выявил широко распространенное эндонуклеолитическое расщепление, зависимое от микроРНК и независимое от микроРНК» . Исследования нуклеиновых кислот . 39 (13): 5658–5668. дои : 10.1093/nar/gkr110 . ПМК   3141239 . ПМИД   21427086 .
  21. ^ Ю, Дунлян; Сюй, Мин; Ито, Хидетака; Шао, Вэйшань; Ма, Сяося; Ван, Хуэйчжун; Мэн, Ицзюнь (2018). «Отслеживание сигналов обработки микроРНК с помощью анализа данных деградомного секвенирования» . Границы генетики . 9 : 546. дои : 10.3389/fgene.2018.00546 . ISSN   1664-8021 . ПМК   6246748 . ПМИД   30487815 .
  22. ^ Фан, Цзя; Нин, Бо; Лион, Кристофер Дж.; Ху, Тони Ю. (01 января 2017 г.), Ху, Тони Ю.; Таманои, Фуюхико (ред.), «Глава первая - Циркулирующий пептидом и опухолевой протеолиз» , Ферменты , Пептидомика ферментных продуктов, полученных из рака, 42 , Academic Press: 1–25, doi : 10.1016/bs.enz.2017.08 .001 , ПМИД   29054266 , получено 17 апреля 2023 г.
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: 386da1358e46bea0cadd9a79c1561f1a__1708593960
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/38/1a/386da1358e46bea0cadd9a79c1561f1a.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Degradome sequencing - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)