Пиросеквенирование

Пиросеквенирование — это метод секвенирования ДНК (определения порядка нуклеотидов в ДНК), основанный на принципе «секвенирования путем синтеза», при котором секвенирование осуществляется путем обнаружения нуклеотида, включенного ДНК-полимеразой . Пиросеквенирование основано на обнаружении света, основанном на цепной реакции высвобождения пирофосфата . Отсюда и название пиросеквенирование.

Принцип пиросеквенирования был впервые описан в 1993 году. ^[1] Бертил Петтерссон, Матиас Улен и Пол Нюрен путем объединения твердофазного секвенирования. метода ^[2] использование покрытых стрептавидином магнитных шариков с рекомбинантной ДНК-полимеразой, лишенной 3'-5'-экзонуклеазной активности (корректура), и обнаружение люминесценции с использованием фермента люциферазы светлячка . ^[3] Смесь трех ферментов ( ДНК-полимераза , АТФ-сульфуралаза и люцифераза светлячка ) и нуклеотид ( dNTP ) добавляются к одноцепочечной ДНК для секвенирования, а за включением нуклеотида следует измерение излучаемого света. Интенсивность света определяет, были ли включены 0, 1 или более нуклеотидов, тем самым показывая, сколько комплементарных нуклеотидов присутствует в цепи матрицы. Смесь нуклеотидов удаляют перед добавлением следующей смеси нуклеотидов. Этот процесс повторяется с каждым из четырех нуклеотидов до тех пор, пока не будет определена последовательность ДНК одноцепочечной матрицы.

Второй метод пиросеквенирования, основанный на растворе, был описан в 1998 году. ^[4] Мостафа Ронаги , Матиас Улен и Пол Нюрен . дополнительный фермент апираза В этом альтернативном методе вводится для удаления нуклеотидов, которые не включены ДНК-полимеразой. Это позволило добавлять смесь ферментов, включающую ДНК-полимеразу , люциферазу и апиразу , в начале и сохранять ее на протяжении всей процедуры, обеспечивая тем самым простую установку, подходящую для автоматизации. Автоматизированный прибор, основанный на этом принципе, был представлен на рынке в следующем году компанией Pyrosequencing.

Третий микрофлюидный вариант метода пиросеквенирования был описан в 2005 году. ^[5] Джонатан Ротберг и его коллеги из компании 454 Life Sciences . Этот альтернативный подход к пиросеквенированию был основан на оригинальном принципе прикрепления ДНК, подлежащей секвенированию, к твердой подложке, и они показали, что секвенирование может выполняться в высокой степени параллельным образом с использованием , изготовленного на основе микрочипов микрочипа . Это позволило провести высокопроизводительное секвенирование ДНК, и на рынке появился автоматизированный инструмент. Это стал первый инструмент для секвенирования следующего поколения, открывший новую эру в исследованиях в области геномики , когда быстро падающие цены на секвенирование ДНК позволили секвенировать весь геном по доступным ценам.

Процедура

«Секвенирование путем синтеза» включает в себя взятие одной цепи ДНК для секвенирования и последующий ферментативный синтез ее комплементарной цепи. Метод пиросеквенирования основан на обнаружении активности ДНК-полимеразы (фермента, синтезирующего ДНК) с другим хемолюминесцентным ферментом . По сути, этот метод позволяет секвенировать одну цепь ДНК, синтезируя вдоль нее комплементарную цепь, по одной паре оснований за раз, и определяя, какое основание фактически было добавлено на каждом этапе. ДНК-матрица неподвижна, растворы нуклеотидов A, C, G и T последовательно добавляются и удаляются из реакции. Свет возникает только тогда, когда раствор нуклеотидов дополняет первое неспаренное основание матрицы. Последовательность растворов, генерирующих хемилюминесцентные сигналы, позволяет определить последовательность матрицы. ^[6]

Для версии пиросеквенирования на основе раствора матрица одноцепочечной ДНК ( оцДНК ) гибридизуется с праймером для секвенирования и инкубируется с ферментами ДНК-полимеразой , АТФ-сульфурилазой , люциферазой и апиразой , а также с субстратами аденозин-5'-фосфосульфатом (APS). и люциферин .

Добавление одного из четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов ( dNTP ) (dATPαS, который не является субстратом для люциферазы, добавляется вместо dATP, чтобы избежать шума), инициирует второй этап. ДНК-полимераза включает в матрицу правильные комплементарные дНТФ. Это включение высвобождает пирофосфат (PPi).
АТФ-сульфуралаза превращает PPi в АТФ в присутствии аденозин-5'-фосфосульфата. Этот АТФ действует как субстрат для опосредованного люциферазой превращения люциферина в оксилюциферин, который генерирует видимый свет в количествах, пропорциональных этому количеству. Свет, образующийся в результате реакции, катализируемой люциферазой, фиксируется камерой и анализируется в программе.
Неинкорпорированные нуклеотиды и АТФ разлагаются апиразой , и реакция может возобновиться с использованием другого нуклеотида.

Процесс можно представить следующими уравнениями:

PPi + APS → АТФ + Сульфат (катализируется АТФ-сульфурилазой);
АТФ + люциферин + О2 → АМФ + РРi + оксилюциферин + СО ₂ + hv (катализируется люциферазой);

где:

PPi — пирофосфат.
АПС представляет собой аденозин-5-фосфосульфат;
АТФ – аденозинтрифосфат;
O2 – молекула кислорода;
АМФ – аденозинмонофосфат;
СО ₂ представляет собой диоксид углерода;
hv — свет.

Ограничения

В настоящее время ограничением метода является то, что длины отдельных прочтений последовательности ДНК составляют около 300-500 нуклеотидов, что меньше, чем 800-1000, которые можно получить с помощью методов терминации цепи (например, секвенирования по Сэнгеру). Это может затруднить процесс сборки генома , особенно для последовательностей, содержащих большое количество повторяющейся ДНК . Отсутствие корректуры ограничивает точность этого метода.

Коммерциализация

Компания Pyrosequencing AB в Уппсале, Швеция, была основана на венчурный капитал , предоставленный HealthCap, с целью коммерциализации оборудования и реагентов для секвенирования коротких участков ДНК с использованием метода пиросеквенирования. Компания Pyrosequencing AB была зарегистрирована на Стокгольмской фондовой бирже в 1999 году. В 2003 году она была переименована в Biotage. ^[7] Бизнес-направление пиросеквенирования было приобретено компанией Qiagen в 2008 году. В дальнейшем лицензия на технологию пиросеквенирования была передана компании 454 Life Sciences . 454 разработали технологию пиросеквенирования на основе массивов, которая стала платформой для крупномасштабного секвенирования ДНК , включая секвенирование генома и метагеномику .

Компания Roche объявила о прекращении выпуска платформы секвенирования 454 в 2013 году. ^[8]

Ссылки

^ Найрен, Петтерссон и Улен (1993) «Твердофазное мини-секвенирование ДНК с помощью ферментативного люминометрического анализа обнаружения неорганических пирофосфатов» Аналитическая биохимия 208 (1), 171-175, https://doi.org/10.1006/abio.1993.1024
^ Улен (1989) «Магнитное разделение ДНК» Nature 340: 733-4, https://doi.org/10.1038/340733a0
^ Найрен и Лундин (1985) «Ферментативный метод непрерывного мониторинга синтеза неорганического пирофосфата» Аналитическая биохимия 151 (2): 504-509. https://doi.org/10.1016/0003-2697(85)90211-8
^ Ронаги, Мостафа; Улен, Матиас; Нюрен, Пол (17 июля 1998 г.). «Метод секвенирования на основе пирофосфата реального времени» . Наука . 281 (5375): 363–365. дои : 10.1126/science.281.5375.363 . ПМИД 9705713 . S2CID 26331871 .
^ Маргилес и др. (2005) «Секвенирование генома в микрофабрикатных пиколитровых реакторах высокой плотности» Nature 437, 376-380. https://doi.org/doi:10.1038/nature03959 ;
^ ЦЯГЕН. «Обзор технологии и платформы пиросеквенирования» . Проверено 4 августа 2017 г.
^ Биотаж. «История биотажа» . www.biotage.com . Проверено 19 сентября 2022 г.
^ Холлмер, Марк (17 октября 2013 г.). «Roche закроет 454 Life Sciences, поскольку это снижает фокус на секвенировании генов» . Жестокие биотехнологии .

Дальнейшее чтение

Мецкер М. (2005). «Новые технологии секвенирования ДНК» . Геномные исследования . 15 (12): 1767–76. дои : 10.1101/гр.3770505 . ПМИД 16339375 .

[1] Найрен, Петтерссон и Улен (1993) «Твердофазное мини-секвенирование ДНК с помощью ферментативного люминометрического анализа обнаружения неорганических пирофосфатов» Аналитическая биохимия 208 (1), 171-175, https://doi.org/10.1006/abio.1993.1024

[2] Улен (1989) «Магнитное разделение ДНК» Nature 340: 733-4, https://doi.org/10.1038/340733a0

[3] Найрен и Лундин (1985) «Ферментативный метод непрерывного мониторинга синтеза неорганического пирофосфата» Аналитическая биохимия 151 (2): 504-509. https://doi.org/10.1016/0003-2697(85)90211-8

[4] Ронаги, Мостафа; Улен, Матиас; Нюрен, Пол (17 июля 1998 г.). «Метод секвенирования на основе пирофосфата реального времени» . Наука . 281 (5375): 363–365. дои : 10.1126/science.281.5375.363 . ПМИД 9705713 . S2CID 26331871 .

[5] Маргилес и др. (2005) «Секвенирование генома в микрофабрикатных пиколитровых реакторах высокой плотности» Nature 437, 376-380. https://doi.org/doi:10.1038/nature03959 ;

[6] ЦЯГЕН. «Обзор технологии и платформы пиросеквенирования» . Проверено 4 августа 2017 г.

[7] Биотаж. «История биотажа» . www.biotage.com . Проверено 19 сентября 2022 г.

[8] Холлмер, Марк (17 октября 2013 г.). «Roche закроет 454 Life Sciences, поскольку это снижает фокус на секвенировании генов» . Жестокие биотехнологии .

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]