Активация транскрипции, контролируемая тетрациклином
Активация транскрипции, контролируемая тетрациклином, представляет собой метод индуцируемой экспрессии генов , при котором транскрипция обратимо включается или выключается в присутствии антибиотика тетрациклина или одного из его производных (например, доксициклина ). [1]
Экспрессия генов, контролируемая тетрациклином, основана на механизме устойчивости к лечению антибиотиками тетрациклина, обнаруженном у грамотрицательных бактерий . В природе P tet промотор экспрессирует TetR ( репрессор ) и TetA, белок, который выкачивает антибиотик тетрациклина из клетки. [2]
Разница между Tet-On и Tet-Off не в том, включает или выключает трансактиватор ген, как следует из названия; скорее, оба белка активируют экспрессию. Разница связана с их соответствующей реакцией на тетрациклин или доксициклин (Докс, более стабильный аналог тетрациклина); Tet-Off активирует экспрессию в отсутствие Dox, тогда как Tet-On активируется в присутствии Dox.
Тет-Офф и Тет-Он
[ редактировать ]Две наиболее часто используемые индуцибельные системы экспрессии для исследования биологии клеток эукариот называются Tet-Off и Tet-On. [3] Система Tet-Off для контроля экспрессии интересующих генов в клетках млекопитающих была разработана профессорами Германом Бюжаром и Манфредом Госсеном из Гейдельбергского университета и впервые опубликована в 1992 году. [4]
В системе Tet-Off используется белок трансактиватор тетрациклина (tTA) , который создается путем слияния одного белка , TetR (репрессора тетрациклина), обнаруженного в бактериях Escherichia coli , с доменом активации другого белка, VP16 , обнаруженного в герпесе. простой вирус . [5]
Полученный белок tTA способен связываться с ДНК в определенных TetO последовательностях оператора . В большинстве систем Tet-Off несколько повторов таких последовательностей TetO расположены выше минимального промотора, такого как промотор CMV . Совокупность нескольких последовательностей TetO с минимальным промотором называется элементом ответа на тетрациклин (TRE), поскольку он отвечает на связывание белка-трансактиватора тетрациклина tTA увеличением экспрессии гена или генов, расположенных ниже его промотора.
В системе Tet-Off экспрессия генов, контролируемых TRE, может подавляться тетрациклином и его производными. Они связывают tTA и делают его неспособным связываться с последовательностями TRE, тем самым предотвращая трансактивацию генов, контролируемых TRE.
Система Tet-On работает аналогично, но противоположным образом. В то время как в системе Tet-Off tTA способен связывать оператор только в том случае, если он не связан с тетрациклином или одним из его производных, например доксициклином, в системе Tet-On белок rtTA способен связывать оператора только в том случае, если он связан. с помощью тетрациклина. Таким образом, введение в систему доксициклина инициирует транскрипцию генетического продукта. Систему Tet-On иногда предпочитают Tet-Off из-за ее более быстрого реагирования.
Tet-Off Системы экспрессии также используются для создания трансгенных мышей, которые условно экспрессируют представляющий интерес ген.
Tet-On Advanced и Tet-On 3G
[ редактировать ]Трансактиватор Tet-On Advanced (также известный как rtTA2 С -M2) представляет собой альтернативную версию Tet-On, которая демонстрирует пониженную базальную экспрессию и действует при в 10 раз более низкой концентрации Dox, чем Tet-Off. Кроме того, его экспрессия считается более стабильной в эукариотических клетках благодаря оптимизации кодонов человека и использованию трех минимальных доменов активации транскрипции. Он был открыт в 2000 г. как один из двух улучшенных мутантов Х. Бюжаром и его коллегами после случайного мутагенеза Tet-репрессорной части гена-трансактиватора. [6] Тет-Он 3G (также известный как rtTA-V10 [7] ) похож на Tet-On Advanced, но был создан на основе rtTA2. С -S2 вместо rtTA2 С -М2. Он также оптимизирован по человеческим кодонам и состоит из трех минимальных доменов активации VP16. Однако белок Tet-On 3G имеет пять аминокислотных отличий от белка Tet-On Advanced, что, по-видимому, еще больше повышает его чувствительность к Dox. Tet-On 3G в 100 раз менее чувствителен к Dox и в семь раз более активен, чем оригинальный Tet-On. [8]
Другие системы
[ редактировать ]Другие системы, такие как система T-REx от Life Technologies, работают по-другому. [9] Интересующий ген фланкирован вышестоящим промотором CMV и двумя сайтами TetO2. Экспрессия интересующего гена подавляется за счет высокого сродства связывания гомодимеров TetR с каждой последовательностью TetO2 в отсутствие тетрациклина. Введение тетрациклина приводит к связыванию одного тетрациклина на каждом гомодимере TetR с последующим высвобождением TetO2 гомодимерами TetR. Развязывание гомодимеров TetR и TetO2 приводит к дерепрессии интересующего гена.
Модифицированная версия T-REx представляет собой синтетическую биологическую схему Linearizer , оптимизированную для настройки экспрессии генов в эукариотических клетках (почкующихся дрожжей, человека и т. д.). Встраивая сайты TetO2 в промотор, управляющий экспрессией TetR, он создает отрицательную обратную связь , что обеспечивает гомогенную экспрессию (низкий уровень шума) и линейную реакцию на дозу аналогов тетрациклина. [10]
Элемент ответа на тетрациклин (TRE)
[ редактировать ]В наиболее часто используемых плазмидах элемент ответа на тетрациклин состоит из семи повторов бактериальной последовательности TetO длиной 19 пар оснований (TCCCTATCAGTGATAGAGA), разделенных спейсерными последовательностями (например: ACGATGTCGAGTTTAC). Именно TetO распознается и связывается частью TetR Tet-On или Tet-Off. TRE обычно размещается выше минимального промотора, который имеет очень низкую базальную экспрессию в отсутствие связанного Tet-Off (или Tet-On).
Преимущества и недостатки
[ редактировать ]Система Tet имеет преимущества перед системами условной экспрессии генов Cre , FRT и ER (рецептор эстрогена). В системах Cre и FRT активация или нокаут гена необратимы после завершения рекомбинации, тогда как в системах Tet и ER они обратимы. Система Tet имеет очень жесткий контроль над экспрессией, тогда как система ER несколько негерметична. [11] Однако система Tet, которая зависит от транскрипции и последующей трансляции гена-мишени, действует не так быстро, как система ER, которая стабилизирует уже экспрессированный целевой белок при введении гормона. Кроме того, поскольку последовательность tet-o длиной 19 пар оснований естественным образом отсутствует в клетках млекопитающих, плейотропия считается, что сведена к минимуму по сравнению с гормональными методами контроля. При использовании системы Tet в культуре клеток важно подтвердить, что каждая партия фетальной бычьей сыворотки проверяется на отсутствие примесей тетрациклинов или их слишком малое количество, чтобы мешать индуцируемости.
Механизм действия антибактериального эффекта тетрациклинов основан на нарушении трансляции белков в бактериях, тем самым повреждая способность микробов расти и восстанавливаться; однако трансляция белка также нарушается в митохондриях эукариот, что приводит к эффектам, которые могут исказить экспериментальные результаты. [12]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Госсен М., Фрейндлиб С., Бендер Г., Мюллер Г., Хиллен В., Бужар Х. (июнь 1995 г.). «Активация транскрипции тетрациклинами в клетках млекопитающих». Наука . 268 (5218): 1766–9. Бибкод : 1995Sci...268.1766G . дои : 10.1126/science.7792603 . ПМИД 7792603 .
- ^ Орт П., Шнаппингер Д., Хиллен В., Сенгер В., Хинрикс В. (2000). «Структурные основы регуляции генов с помощью индуцируемой тетрациклином системы репрессор-оператор Tet» (PDF) . Структурная и молекулярная биология природы . 7 (3): 215–219. дои : 10.1038/73324 . ПМИД 10700280 . S2CID 19973826 .
- ^ Tet-On и Tet-Off являются зарегистрированными торговыми марками Clontech Laboratories, Inc. в США.
- ^ Госсен М., Бужар Х. (июнь 1992 г.). «Жесткий контроль экспрессии генов в клетках млекопитающих с помощью тетрациклин-чувствительных промоторов» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 89 (12): 5547–51. Бибкод : 1992PNAS...89.5547G . дои : 10.1073/pnas.89.12.5547 . ПМК 49329 . ПМИД 1319065 .
- ^ Аллен Н.Д., Плагг А., Келси Дж. (2000). «Направленный мутагенез в эмбриональных стволовых клетках». В Джексоне IJ, Эбботте CM (ред.). Мышиная генетика и трансгеника: практический подход . Издательство Оксфордского университета. стр. 259–263. ISBN 978-0-19-963708-9 .
- ^ Урлингер С., Барон У., Тельманн М., Хасан М.Т., Бужар Х., Хиллен В. (июль 2000 г.). «Изучение пространства последовательностей тетрациклин-зависимых активаторов транскрипции: новые мутации приводят к расширению диапазона и чувствительности» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 97 (14): 7963–8. Бибкод : 2000PNAS...97.7963U . дои : 10.1073/pnas.130192197 . ПМК 16653 . ПМИД 10859354 .
- ^ Дас А.Т., Тененбаум Л., Берхаут Б. (июнь 2016 г.). «Системы Tet-On для экспрессии генов, индуцируемой доксициклином» . Современная генная терапия . 16 (3): 156–67. дои : 10.2174/1566523216666160524144041 . ПМК 5070417 . ПМИД 27216914 .
- ^ Чжоу X, Винк М, Клавер Б, Берхаут Б, Дас А.Т. (октябрь 2006 г.). «Оптимизация системы Tet-On для регулируемой экспрессии генов посредством вирусной эволюции» . Джин Тер . 13 (19): 1382–90. дои : 10.1038/sj.gt.3302780 . ПМИД 16724096 .
- ^ «Система T-REx» . ТермоФишер Сайентифик .
- ^ Невожай Д., Адамс Р.М., Мерфи К.Ф., Йосич К., Балажши Г. (31 марта 2009 г.). «Отрицательная ауторегуляция линеаризирует реакцию на дозу и подавляет гетерогенность экспрессии генов» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 106 (13): 5123–8. Бибкод : 2009PNAS..106.5123N . дои : 10.1073/pnas.0809901106 . ПМЦ 2654390 . ПМИД 19279212 .
- ^ Сохал Д.С., Нгием М., Краковер М.А., Витт С.А., Кимбалл Т.Р., Тимиц К.М., Пеннингер Дж.М., Молкентин Дж.Д. (июль 2001 г.). «Временно регулируемые и тканеспецифичные генные манипуляции во взрослом и эмбриональном сердце с использованием тамоксифен-индуцируемого белка Cre» . Цирк. Рез . 89 (1): 20–25. дои : 10.1161/hh1301.092687 . ПМИД 11440973 .
- ^ Муллан Н., Муширо Л., Ван Х, Рю Д., Уильямс Э.Г., Моттис А., Йовайсайте В., Фрошо М.В., Кирос П.М., Депланке Б., Хауткупер Р.Х., Ауверкс Дж. (март 2015 г.). «Тетрациклины нарушают функцию митохондрий в эукариотических моделях: призыв к осторожности в биомедицинских исследованиях» . Представитель ячейки . 10 (10): 1681–1691. дои : 10.1016/j.celrep.2015.02.034 . ПМЦ 4565776 . ПМИД 25772356 .
- Чациспиру И.А., Хелд Н.М., Муширо Л., Ауверкс Дж., Хауткупер Р.Х. (ноябрь 2015 г.). «Тетрациклиновые антибиотики нарушают функцию митохондрий, и их экспериментальное использование сбивает с толку исследования» . Рак Рез . 75 (21): 4446–9. дои : 10.1158/0008-5472.CAN-15-1626 . ПМЦ 4631686 . ПМИД 26475870 .