Микрофлюидное гаплотипирование всего генома

Микрофлюидное гаплотипирование всего генома — это метод физического отделения отдельных хромосом от метафазной клетки с последующим прямым разрешением гаплотипа для каждой аллели.

Фон

Полногеномное гаплотипирование

Полногеномное гаплотипирование — это процесс определения личных гаплотипов на основе всего генома . ^[1] Современные методы секвенирования следующего поколения способны идентифицировать гетерозиготные локусы, но они не очень подходят для определения того, какие полиморфизмы существуют на одной и той же (цис) или аллельной (транс) цепи ДНК. Информация о гаплотипах способствует пониманию потенциальных функциональных эффектов цис- или транс-вариантов. Гаплотипы чаще определяются путем вывода путем сравнения с родительскими генотипами или на основе популяционных выборок с использованием статистических вычислительных методов для определения неравновесия по сцеплению между маркерами. Прямое гаплотипирование возможно путем выделения хромосом или сегментов хромосом. Большинство методов молекулярной биологии гаплотипирования позволяют точно определить гаплотипы только ограниченной области генома. Прямое гаплотипирование всего генома включает определение гаплотипа на уровне всего генома, обычно путем выделения отдельных хромосом.

Гаплотип

Гаплотип . Гаплотипы (гапло: от древнегреческого ἁπλόος (haploos, «одиночный, простой») — это непрерывный участок тесно связанных сегментов ДНК в пределах более крупного генома , которые, как правило, наследуются вместе как единица на одной хромосоме не имеют определенного определения. SNP) , ( Этот термин также используется для описания групп однонуклеотидных полиморфизмов которые статистически связаны. Большая часть знаний об ассоциации SNP получена благодаря усилиям Международного проекта HapMap , который зарекомендовал себя как мощный ресурс в разработке общедоступной базы данных генетических вариаций человека.

Поэтапность

Фазирование — это процесс выявления индивидуального набора гомологичных хромосом . Методы поэтапного определения включают анализ родословной, аллель-специфическую ПЦР , анализ гаплотипов методом эмульсионной ПЦР, ^[2] ПЦР- полировка , ^[3] типирование спермы, клонирование искусственных бактериальных хромосом , создание гибридов соматических клеток, атомно-силовая микроскопия и другие. Фазирование гаплотипов также может быть достигнуто с помощью методов вычислительного вывода.

Микрофлюидика

Микрофлюидика относится к использованию микроканалов в микроэлектромеханической системе ( МЭМС ). ^[4] Микрофлюидные каналы имеют диаметр 10–100 мкм, что позволяет манипулировать и анализировать мельчайшие объемы. Эта технология сочетает в себе инженерию, физику, химию, биологию и оптику. За последние десятилетия они произвели революцию в микро- и наномасштабной биологии, генетике и протеомике. Микрофлюидные устройства могут объединять несколько аналитических этапов в одном устройстве. Эту технологию некоторые называют «лабораторией на чипе». В большинстве современных методов молекулярной биологии используются те или иные формы МЭМС, включая технологию микрочипов и инструменты для секвенирования нового поколения .

Микрофлюидная прямая детерминированная фазировка

Принцип

Прямая детерминированная фазировка отдельных хромосом может быть достигнута путем выделения отдельных хромосом для генетического анализа с помощью микрофлюидного устройства. ^[5]

Методы

Микрофлюидное разделение и амплификация хромосом. — Рабочий процесс микрофлюидной изоляции и амплификации полногеномных хромосом. Не в масштабе

одну метафазную Из раствора выделяют клетку. Затем хромосомы высвобождаются из ядра, а цитоплазма ферментативно переваривается. Затем суспензия хромосом направляется к множественным каналам разделения. Хромосомы физически направляются в разделительные каналы с помощью ряда клапанов. В первом описании этого метода Fan et al. разработал специальную программу (MatLab) для управления этим процессом. После разделения хромосомы готовят к амплификации путем последовательного добавления и отмывания трипсина, денатурационного буфера и нейтрализующего раствора. После этого ДНК готова к дальнейшей обработке. Из-за небольшого количества ДНК амплификацию необходимо проводить с использованием наборов, специально предназначенных для очень небольших исходных количеств ДНК. Амплифицированная ДНК вымывается из микрофлюидного устройства и растворяется добавлением буфера. Амплифицированную ДНК теперь можно анализировать различными методами.

После того как хромосомы изолированы и амплифицированы, можно применять любое молекулярное гаплотипирование, пока хромосомы остаются различными. Этого можно достичь, если держать их физически разделенными или идентифицировать каждый образец путем генотипирования. После идентификации каждой хромосомы каждую пару гомологов можно разделить на один из двух гаплоидных геномов.

Приложения

Микрофлюидная прямая детерминированная фазировка позволяет изолировать все хромосомы в одном эксперименте. Эта уникальная особенность предполагает возможные применения в клинической, исследовательской и личной геномике. Некоторые из возможных клинических применений этого метода включают фазирование множественных мутаций, когда родительские образцы недоступны, преимплантационную генетическую диагностику , пренатальную диагностику и характеристику раковых клеток.

Гаплотипирование всего генома с помощью микрофлюидики увеличит скорость открытий в рамках проекта HapMap и предоставит возможность подтверждения и обнаружения ошибок в существующей базе данных. Это послужит дополнительной информацией для исследований генетических ассоциаций.

По мере совершенствования методов амплификации небольших количеств ДНК становится возможным секвенирование отдельных хромосом с использованием микрофлюидики для разделения каждой отдельной хромосомы. Экономически эффективным подходом может быть штрих-кодирование каждой отдельной хромосомы и выполнение параллельного повторного секвенирования всего индивидуального генома. Амплификация каждой хромосомы в отдельности также обеспечивает механизм потенциального заполнения некоторых пробелов, остающихся в эталонном геноме человека . Секвенирование одной хромосомы позволит связать некартированные последовательности с одной хромосомой. Кроме того, секвенирование одной хромосомы будет более точным при идентификации вариантов числа копий и повторяющихся последовательностей.

Ограничения

По состоянию на январь 2011 года только одна публикация описала использование этой техники. ^[5] Научное сообщество ожидает дальнейшего подтверждения этого метода и его эффективности в выделении и амплификации анализируемых количеств ДНК. Хотя этот метод действительно упрощает процесс выделения хромосом, некоторые его этапы, такие как первоначальное выделение метафазной клетки, остаются сложными и трудоемкими. Другие автоматизированные методы разделения метафазных клеток позволят повысить производительность. Кроме того, этот метод применим только к клеткам в метафазе, что по своей сути ограничивает метод типами клеток и тканями, которые подвергаются митозу . Анализ отдельных клеток не учитывает возможность мозаицизма ; следовательно, приложения для диагностики и исследования рака обязательно потребуют обработки нескольких клеток. Наконец, поскольку весь этот процесс основан на амплификации из одной клетки, точность любого генетического анализа ограничивается способностью коммерчески доступных платформ производить достаточное количество объективных и безошибочных ампликонов.

Альтернативные методы полногеномного гаплотипирования

Микродиссекция хромосом

Микродиссекция хромосом — еще один процесс выделения отдельных хромосом для генетического анализа. Как и в описанном выше методе, микродиссекция начинается с метафазных клеток. Ядро механически лизируют на предметном стекле, а часть генетического материала разделяют под микроскопом. Фактически микродиссекция генетического материала первоначально осуществлялась с помощью осторожного использования тонкой иглы. Сегодня доступны лазеры с компьютерным управлением. Изолированная геномная область может варьироваться от части одной хромосомы до нескольких хромосом. Для гаплотипирования всего генома микропрепарированный геномный участок амплифицируют и генотипируют или секвенируют. Как и в случае с микрофлюидной техникой, для решения проблемы небольшого исходного образца ДНК необходимы специализированные платформы амплификации. ^[6]^[7]^[8]

Клонирование большой вставки

Случайное разделение полной библиотеки диплоидных фосфорид на различные пулы одинакового размера представляет собой альтернативный метод фазирования гаплотипов. В доказательстве принципа описания этой техники ^[9] Было создано 115 пулов, содержащих около 5000 уникальных клонов из оригинальной библиотеки фосфорид. Каждый из этих пулов содержал примерно 3% генома. Учитывая 3% в каждом пуле и тот факт, что каждый клон представляет собой случайную выборку диплоидного генома, в 99,1% случаев каждый пул содержит ДНК одного гомолога. Амплификация и анализ каждого пула обеспечивают разрешение гаплотипов, ограниченное только размером фосмидной вставки.

Ссылки

^ Следующий этап в генетике человека. Бансал В. и др. Нат Биотехнологий. Январь 2011 г.;29(1):38-9.
^ Связывание гаплотипического анализа эмульсионной ПЦР. Ветмур Дж.Г., Чен Дж. Методы Мол Биол. 2011;687:165-75. ПМИД 20967607
^ Дальнее полонное гаплотипирование отдельных молекул хромосом человека. Чжан К. и др. Нат. Жене. 2006;38:382–87
^ микрофлюидика для биологических приложений. Файнхаут Э, Тянь У.К. Спрингер США. 2009.
^ Jump up to: ^а ^б Полногеномное молекулярное гаплотипирование одиночных клеток. Fan HC и др. Нат Биотехнологий. 2011 год
^ Амплификация всего генома из микрорасчлененных хромосом. М. Хокнер и др. Цитогенетические и геномные исследования 2009 г.; 125:98-102
^ Прямое определение молекулярных гаплотипов путем микродиссекции хромосом. Л. Ма и др. Природные методы, том. 7 нет. 4 299-301.
^ Специфическая для хромосом сегментация, выявленная с помощью структурного анализа индивидуально изолированных хромосом. К. Китада и др. Гены, хромосомы и рак, 50(4): 217–227, апрель 2011 г.
^ Секвенирование генома индийского человека с гаплотипом. Дж. О. Китцман и др. Природная биотехнология, том 29, № 1, 59–63.

Внешние ссылки

[1] Следующий этап в генетике человека. Бансал В. и др. Нат Биотехнологий. Январь 2011 г.;29(1):38-9.

[2] Связывание гаплотипического анализа эмульсионной ПЦР. Ветмур Дж.Г., Чен Дж. Методы Мол Биол. 2011;687:165-75. ПМИД 20967607

[3] Дальнее полонное гаплотипирование отдельных молекул хромосом человека. Чжан К. и др. Нат. Жене. 2006;38:382–87

[4] микрофлюидика для биологических приложений. Файнхаут Э, Тянь У.К. Спрингер США. 2009.

[FanHC-5] Jump up to: ^а ^б Полногеномное молекулярное гаплотипирование одиночных клеток. Fan HC и др. Нат Биотехнологий. 2011 год

[6] Амплификация всего генома из микрорасчлененных хромосом. М. Хокнер и др. Цитогенетические и геномные исследования 2009 г.; 125:98-102

[7] Прямое определение молекулярных гаплотипов путем микродиссекции хромосом. Л. Ма и др. Природные методы, том. 7 нет. 4 299-301.

[8] Специфическая для хромосом сегментация, выявленная с помощью структурного анализа индивидуально изолированных хромосом. К. Китада и др. Гены, хромосомы и рак, 50(4): 217–227, апрель 2011 г.

[9] Секвенирование генома индийского человека с гаплотипом. Дж. О. Китцман и др. Природная биотехнология, том 29, № 1, 59–63.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]