Примыкающий к протоспейсеру мотив
Мотив , прилегающий к протоспейсеру ( PAM из 2–6 пар оснований ), представляет собой последовательность ДНК , следующую сразу за последовательностью ДНК, на которую нацелена Cas9 нуклеаза в CRISPR бактериальной адаптивной иммунной системе . [1] PAM является компонентом вторгшегося вируса или плазмиды, но не обнаруживается в геноме бактериального хозяина и, следовательно, не является компонентом бактериального локуса CRISPR . Cas9 не сможет успешно связываться или расщеплять целевую последовательность ДНК, если за ней не следует последовательность PAM. [2] [3] [4] [5] PAM является важным нацеливающим компонентом, который отличает собственную бактериальную ДНК от чужой, тем самым предотвращая нацеливание и разрушение локуса CRISPR с помощью CRISPR-ассоциированной нуклеазы. [6]
Спейсеры/протоспейсеры
[ редактировать ]В бактериальном геноме локусы CRISPR содержат «спейсеры» (вирусная ДНК, вставленная в локус CRISPR), которые в адаптивных иммунных системах типа II были созданы в результате вторжения вирусной или плазмидной ДНК (так называемые «протоспейсеры»). При последующей инвазии CRISPR-ассоциированная нуклеаза , такая как Cas9, прикрепляется к комплексу tracrRNA – crRNA , который направляет Cas9 к вторгающейся последовательности протоспейсера. Но Cas9 не будет расщеплять последовательность протоспейсера, если не существует соседней последовательности PAM. Спейсер в бактериальных локусах CRISPR не будет содержать последовательность PAM и, следовательно, не будет разрезаться нуклеазой, но протоспейсер в вторгающемся вирусе или плазмиде будет содержать последовательность PAM и, таким образом, будет расщепляться нуклеазой Cas9. [4] В приложениях для редактирования генома синтезируется короткий олигонуклеотид, известный как направляющая РНК (гРНК), который выполняет функцию комплекса tracrRNA-crRNA по распознаванию последовательностей генов, имеющих последовательность PAM на 3'-конце , тем самым «направляя» нуклеазу к специфическая последовательность, которую нуклеаза способна разрезать. [7] [8]
PAM-последовательности
[ редактировать ]
Канонический PAM представляет собой последовательность 5'-NGG-3', где «N» представляет собой любое нуклеиновое основание, за которым следуют два нуклеиновых основания гуанина («G»). [9] Направляющие РНК могут транспортировать Cas9 в любой локус генома для редактирования гена, но редактирование не может происходить ни на каком сайте, кроме того, в котором Cas9 распознает PAM. Канонический PAM связан с нуклеазой Cas9 Streptococcus pyogenes (обозначается SpCas9), тогда как различные PAM связаны с белками Cas9 бактерий Neisseria meningitidis , Treponema denticola и Streptococcus thermophilus . [10] 5'-NGA-3' может быть высокоэффективным неканоническим PAM для клеток человека, но эффективность зависит от местоположения генома. [11] Были предприняты попытки спроектировать Cas9 для распознавания различных PAM, чтобы улучшить способность CRISPR-Cas9 редактировать гены в любом желаемом месте генома. [12]
Cas9 Francisco novicida распознает каноническую последовательность PAM 5’-NGG-3’, но был сконструирован так, чтобы распознавать 5’-YG-3’ (где «Y» представляет собой пиримидин [13] ), тем самым расширяя диапазон возможных целей Cas9. [14] Нуклеаза Cpf1 Francisco novicida распознает 5'-TTTN-3' PAM. [15] или 5'-YTN-3'. [16]
Помимо CRISPR-Cas9 и CRISPR-Cpf1, несомненно, существует множество еще не открытых нуклеаз и PAM. [17]
CRISPR/Cas13a (ранее C2c2 [18] ) из бактерии Leptotrichia shahii представляет собой систему CRISPR, управляемую РНК, которая нацелена на последовательности в РНК, а не в ДНК. PAM не имеет отношения к CRISPR, нацеленному на РНК, хотя гуанин, фланкирующий мишень, отрицательно влияет на эффективность и был назван «сайтом фланкирования протоспейсера» (PFS). [19]
GUIDE-Seq
[ редактировать ]Технология под названием GUIDE-Seq была разработана для анализа нецелевых расщеплений, вызванных таким редактированием генов. [20] Требование PAM можно использовать для специфического воздействия на однонуклеотидные гетерозиготные мутации, не оказывая при этом аберрантных эффектов на аллели дикого типа. [21]
См. также
[ редактировать ]Внешние ссылки
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Шах С.А., Эрдманн С., Мохика Ф.Дж., Гаррет Р.А. (2013). «Мотивы распознавания протоспейсеров: смешанные идентичности и функциональное разнообразие» . Биология РНК . 10 (5): 891–899. дои : 10.4161/rna.23764 . ПМЦ 3737346 . ПМИД 23403393 .
- ^ Мохика Ф.Д., Диес-Вильясеньор К., Гарсиа-Мартинес Х., Альмендрос К. (2009). «Короткие последовательности мотивов определяют цели прокариотической защитной системы CRISPR» . Микробиология . 155 (Часть 3): 733–740. дои : 10.1099/mic.0.023960-0 . ПМИД 19246744 .
- ^ Шах С.А., Эрдманн С., Мохика Ф.Дж., Гаррет Р.А. (2013). «Мотивы распознавания протоспейсеров: смешанные идентичности и функциональное разнообразие» . Биология РНК . 10 (5): 891–899. дои : 10.4161/rna.23764 . ПМЦ 3737346 . ПМИД 23403393 . Архивировано из оригинала 4 сентября 2014 г.
- ^ Jump up to: а б Джинек М., Чилински К., Фонфара И., Хауэр М., Дудна Дж.А., Шарпантье Э. (2012). «Программируемая ДНК-эндонуклеаза, управляемая двойной РНК, в адаптивном бактериальном иммунитете» . Наука . 337 (6096): 816–821. Бибкод : 2012Sci...337..816J . дои : 10.1126/science.1225829 . ПМК 6286148 . ПМИД 22745249 .
- ^ Штернберг С.Х., Реддинг С., Джинек М., Грин ЕС, Дудна Дж.А. (2014). «Опрос ДНК с помощью CRISPR-РНК-ориентированной эндонуклеазы Cas9» . Природа . 507 (7490): 62–67. Бибкод : 2014Natur.507...62S . дои : 10.1038/nature13011 . ПМК 4106473 . ПМИД 24476820 .
- ^ Мали П., Эсвелт К.М., генеральный директор Церкви (2013). «Cas9 как универсальный инструмент инженерной биологии» . Природные методы . 10 (10): 957–963. дои : 10.1038/nmeth.2649 . ПМК 4051438 . ПМИД 24076990 .
- ^ Мали П., Ян Л., Эсвелт К.М., Аах Дж., Гуэлл М., ДиКарло Дж.Э., Норвилл Дж.Э., Черч ГМ (2013). «Инженерия генома человека под контролем РНК с помощью Cas9» . Наука . 339 (6121): 823–826. Бибкод : 2013Sci...339..823M . дои : 10.1126/science.1232033 . ПМЦ 3712628 . ПМИД 23287722 .
- ^ Конг Л., Ран Ф.А., Кокс Д., Лин С., Барретто Р., Хабиб Н., Сюй П.Д., Ву Х, Цзян В., Марраффини Л.А., Чжан Ф (2013). «Мультиплексная геномная инженерия с использованием систем CRISPR/Cas» . Наука . 339 (6121): 819–823. Бибкод : 2013Sci...339..819C . дои : 10.1126/science.1231143 . ПМЦ 3795411 . ПМИД 23287718 .
- ^ Андерс С., Нивонер О., Дюрст А., Джинек М. (2014). «Структурные основы PAM-зависимого распознавания целевой ДНК эндонуклеазой Cas9» . Природа . 513 (7519): 569–573. Бибкод : 2014Natur.513..569A . дои : 10.1038/nature13579 . ПМК 4176945 . ПМИД 25079318 .
- ^ Эсвелт К.М., Мали П., Брафф Дж.Л., Моосбернер М., Яунг С.Дж., Черч ГМ (2013). «Ортогональные белки Cas9 для регуляции и редактирования генов, управляемых РНК» . Природные методы . 10 (11): 1116–1123. дои : 10.1038/nmeth.2681 . ПМЦ 3844869 . ПМИД 24076762 .
- ^ Чжан Ю, Гэ Икс, Ян Ф, Чжан Л, Чжэн Дж, Тан Икс, Цзинь ЗБ, Цюй Дж, Гу Ф (2014). «Сравнение неканонических PAM для CRISPR/Cas9-опосредованного расщепления ДНК в клетках человека» . Научные отчеты . 4 : 5405. Бибкод : 2014NatSR...4E5405Z . дои : 10.1038/srep05405 . ПМК 4066725 . ПМИД 24956376 .
- ^ Кляйнстивер Б.П., Прев М.С., Цай С.К., Топкар В.В., Нгуен Н.Т., Чжэн З., Гонсалес А.П., Ли З., Петерсон Р.Т., Йе Дж.Р., Арье М.Дж., Йонг Дж.К. (2015). «Сконструированные нуклеазы CRISPR-Cas9 с измененными специфичностями PAM» . Природа . 523 (7561): 481–485. Бибкод : 2015Natur.523..481K . дои : 10.1038/nature14592 . ПМК 4540238 . ПМИД 26098369 .
- ^ «Нуклеотидные коды, коды аминокислот и генетические коды» . KEGG: Киотская энциклопедия генов и геномов. 15 июля 2014 года . Проверено 06 апреля 2016 г.
- ^ Хирано Х., Гутенберг Дж.С., Хории Т., Абудайе О.О., Кимура М., Сюй П.Д., Накане Т., Ишитани Р., Хатада И., Чжан Ф., Нисимасу Х., Нуреки О (2016). «Структура и инженерия Франциселлы Новичиды Cas9» . Ячейка 164 (5): 950–961. дои : 10.1016/j.cell.2016.01.039 . ПМЦ 4899972 . ПМИД 26875867 .
- ^ Зетше Б., Гутенберг Дж.С., Абудайе О.О., Слеймейкер И.М., Макарова К.С., Эсслетцбихлер П., Фольц С.Е., Йонг Дж., ван дер Ост Дж., Регев А., Кунин Е.В., Чжан Ф. (2015). «Cpf1 представляет собой единственную РНК-ориентированную эндонуклеазу системы CRISPR-Cas класса 2» . Клетка . 163 (3): 759–771. дои : 10.1016/j.cell.2015.09.038 . ПМЦ 4638220 . ПМИД 26422227 .
- ^ Фонфара И, Рихтер Х, Братович М, Ле Рун А, Шарпантье Э (2016). «Связанный с CRISPR фермент, расщепляющий ДНК Cpf1, также обрабатывает РНК-предшественник CRISPR». Природа . 532 (7600): 517–521. Бибкод : 2016Natur.532..517F . дои : 10.1038/nature17945 . ПМИД 27096362 . S2CID 2271552 .
- ^ «Даже CRISPR» . Экономист . ISSN 0013-0613 . Проверено 27 мая 2016 г.
- ^ Шмаков С и др. (2017). «Разнообразие и эволюция систем CRISPR-Cas класса 2» . Нат. Преподобный Микробиол. 15 (3): 169–182. дои : 10.1038/nrmicro.2016.184 . ПМЦ 5851899 . ПМИД 28111461 .
- ^ Абудайе О.О., Гутенберг Дж.С., Конерманн С., Йонг Дж., Слеймейкер И.М., Кокс Д.Б., Шмаков С., Макарова К.С., Семенова Е., Минахин Л., Северинов К., Регев А., Ландер Е.С., Кунин Е.В., Чжан Ф (2016). «C2c2 представляет собой однокомпонентный программируемый РНК-направляемый эффектор CRISPR, нацеленный на РНК» . Наука . 353 (6299): aaf5573. doi : 10.1126/science.aaf5573 . ПМК 5127784 . ПМИД 27256883 .
- ^ Цай С.К., Чжэн З., Нгуен Н.Т., Либерс М., Топкар В.В., Тапар В., Вивекенс Н., Хайтер С., Иафрате А.Дж., Ле Л.П., Арье М.Дж., Йонг Дж.К. (2015). «GUIDE-seq обеспечивает полногеномное профилирование нецелевого расщепления ядрами CRISPR-Cas» . Природная биотехнология . 33 (2): 187–197. дои : 10.1038/nbt.3117 . ПМК 4320685 . ПМИД 25513782 .
- ^ Ли Ю, Мендиратта С., Эрхардт К., Кашьяп Н., Уайт М.А., Блерис Л. (2016). «Использование ограничения PAM CRISPR/Cas9 для вмешательств по разрешению одиночных нуклеотидов» . ПЛОС Один . 11 (1): e0144970. Бибкод : 2016PLoSO..1144970L . дои : 10.1371/journal.pone.0144970 . ПМЦ 4720446 . ПМИД 26788852 .