Одномолекулярный эксперимент

Отдельные молекулы полимера (цепочки толщиной 0,4 нм), зарегистрированные в водной среде при различных значениях pH с помощью АСМ . Резкое изменение конформации полимерной цепи наблюдается при небольшом изменении pH. ^[1]

Эксперимент с одной молекулой — это эксперимент, в котором исследуются свойства отдельных молекул . Исследования одиночных молекул можно противопоставить измерениям ансамбля или объемной коллекции молекул, где невозможно различить индивидуальное поведение молекул и только средние можно измерить характеристики. Поскольку многие методы измерения в биологии, химии и физике недостаточно чувствительны, чтобы наблюдать отдельные молекулы, методы флуоресценции одиночных молекул (появившиеся с 1990-х годов для исследования различных процессов на уровне отдельных молекул) вызвали большое волнение, поскольку они предоставили много новых подробностей об измеряемых процессах, которые были недоступны в прошлом. Действительно, с 1990-х годов было разработано множество методов исследования отдельных молекул. ^[2]

Первые эксперименты с одиночными молекулами были экспериментами с патч-клампом , проведенными в 1970-х годах, но они ограничивались изучением ионных каналов . Сегодня системы, исследуемые с использованием методов одиночных молекул, включают движение миозина по актиновым нитям в мышечной ткани и спектроскопические детали отдельных локальных сред в твердых телах. Конформации биологических полимеров были измерены с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ). С помощью силовой спектроскопии отдельные молекулы (или пары взаимодействующих молекул), обычно полимеры , можно механически растянуть, а их упругий отклик записать в реальном времени.

История

В газовой фазе при сверхнизких давлениях эксперименты с одиночными молекулами проводятся уже несколько десятилетий, но в конденсированной фазе только с 1989 года, благодаря работе В. Е. Мёрнера и Лотара Кадора. ^[3] Год спустя Мишель Оррит и Жаки Бернар смогли также продемонстрировать обнаружение поглощения отдельных молекул по их флуоресценции. ^[4]

Многие методы позволяют наблюдать одну молекулу за раз, особенно масс-спектрометрия , при которой обнаруживаются отдельные ионы. Кроме того, один из первых способов обнаружения одиночных молекул появился в области ионных каналов с разработкой патч-зажима техники Эрвином Неером и Бертом Сакманном (которые позже получили Нобелевскую премию за свой плодотворный вклад). . Однако идея измерения проводимости для изучения отдельных молекул наложила серьезные ограничения на виды систем, которые можно было наблюдать.

Флуоресценция — удобный способ наблюдения за одной молекулой, главным образом благодаря чувствительности коммерческих оптических детекторов, способных считать отдельные фотоны. Однако спектроскопически наблюдение одной молекулы требует, чтобы молекула находилась в изолированной среде и излучала фотоны при возбуждении, что благодаря технологии обнаружения одиночных фотонов с использованием фотоумножителей (ФЭУ) или лавинных фотодиодов (ЛФД), позволяет регистрировать события эмиссии фотонов с высокой чувствительностью и временным разрешением.

В последнее время флуоресценция одиночных молекул стала предметом повышенного интереса для биологической визуализации посредством мечения биомолекул, таких как белки и нуклеотиды, для изучения ферментативной функции, которую нелегко изучить в массовом масштабе из-за тонких зависящих от времени движений в катализе. и структурная реорганизация. Наиболее изученным белком является класс ферментов миозина/актина, обнаруженных в мышечных тканях. С помощью методов одиночных молекул ступенчатый механизм был обнаружен и охарактеризован во многих из этих белков.

В 1997 году обнаружение одиночных молекул было продемонстрировано с помощью рамановской спектроскопии с поверхностным усилением (SERS) Катрин Кнайпп , Х. Кнейппом, Ю. Вангом, Л.Т. Перельманом и другими. ^[5] в Массачусетском технологическом институте и независимо С. Ни и С. Р. Эмори в Университете Индианы . ^[6] Команда Массачусетского технологического института использовала нерезонансное рамановское возбуждение и усиление поверхности с помощью нанокластеров серебра для обнаружения одиночных молекул крезилового фиолетового , в то время как команда из Университета Индианы использовала резонансное рамановское возбуждение и усиление поверхности с помощью наночастиц серебра для обнаружения одиночных молекул родамина 6G .

Наноманипуляторы, такие как атомно-силовой микроскоп, также подходят для биологически значимых экспериментов с одиночными молекулами, поскольку они работают в том же масштабе длины, что и большинство биологических полимеров. Кроме того, атомно-силовая микроскопия (АСМ) пригодна для исследования молекул синтетических полимеров. АСМ предоставляет уникальную возможность 3D-визуализации полимерных цепей. Например, режим постукивания АСМ достаточно мягок для регистрации адсорбированных молекул полиэлектролита (например, цепей поли(2-винилпиридина) толщиной 0,4 нм) в жидкой среде. В этих экспериментах местоположение двухцепочечной суперпозиции соответствует двойной толщине одиночной цепи (0,8 нм в случае упомянутого примера). При использовании правильных параметров сканирования конформация таких молекул остается неизменной в течение нескольких часов, что позволяет проводить эксперименты в жидких средах с различными свойствами. ^[1] Кроме того, контролируя силу между наконечником и образцом, можно получить изображения с высоким разрешением. ^[7]^[8] Оптические пинцеты также использовались для изучения и количественной оценки взаимодействий ДНК-белок. ^[7]^[8]

Об экспериментах

Концепция

Флуоресцентная спектроскопия одиночных молекул использует флуоресценцию молекулы для получения информации о ее окружении, структуре и положении. Этот метод дает возможность получать информацию, которая иначе не была бы доступна из-за усреднения по ансамблю (т. е. сигнал, полученный при одновременной регистрации множества молекул, представляет собой среднее свойство динамики молекул). Результаты многих экспериментов с отдельными молекулами представляют собой траектории с двумя состояниями .

Одноканальная запись

Два примера данных (~ 10 с каждый) из эксперимента по одноканальной записи с использованием метода патч-клампа. Верхний след соответствует более низкой концентрации, тогда как нижний след регистрируется при концентрации агониста вблизи ЕС ₅₀ этого ионного канала . Отверстия каналов представлены отклонениями вниз, в данном случае отклонениями примерно 5 пА.

Как и в случае флуоресцентной спектроскопии одиночной молекулы, метод, известный как одноканальная запись, может использоваться для получения конкретной кинетической информации (в данном случае о функции ионного канала), которая недоступна, когда используется ансамблевая запись, например, запись всей клетки. выполненный. ^[9] В частности, ионные каналы чередуются между проводящими и непроводящими классами, которые различаются по конформации. Таким образом, функциональное состояние ионных каналов можно напрямую измерить с помощью достаточно чувствительной электроники при условии принятия надлежащих мер предосторожности для минимизации шума. В свою очередь, каждый из этих классов можно разделить на одно или несколько кинетических состояний, имеющих прямое отношение к основной функции ионного канала. Выполнение этих типов исследований одиночных молекул в систематически изменяющихся условиях (например, концентрация и структура агониста, блокатор проникающих ионов и/или каналов, мутации в аминокислотах ионного канала) может предоставить информацию о взаимном преобразовании различных кинетических состояний ионного канала. ^[10] В минимальной модели ионного канала имеется два состояния : открытое и закрытое. Однако для точного представления данных часто необходимы другие состояния, включая множественные закрытые состояния, а также неактивные и/или десенсибилизированные состояния, которые представляют собой непроводящие состояния, которые могут возникнуть даже в присутствии стимула. ^[9]

Маркировка биомолекул

Отдельные флуорофоры можно химически прикрепить к биомолекулам, таким как белки или ДНК, а динамику отдельных молекул можно отслеживать, контролируя флуоресцентный зонд. пространственные перемещения в пределах предела Рэлея Можно отслеживать , а также изменения интенсивности излучения и/или радиационного времени жизни, которые часто указывают на изменения в местной окружающей среде. Например, мечение одиночных молекул дало огромное количество информации о том, как кинезина моторные белки перемещаются по нитям микротрубочек в мышечных клетках. Визуализация одиночных молекул в живых клетках дает интересную информацию о динамике белка в его физиологическом окружении. Некоторые биофизические параметры динамики белка могут быть определены количественно, такие как коэффициент диффузии, среднеквадратичное смещение, время пребывания, доля связанных и несвязанных молекул, а также механизм поиска цели связывания белка с его целевым сайтом в живой клетке. ^[11]

Резонансный перенос энергии флуоресценции одиночных молекул (FRET)

Основная статья smFRET .

одиночной молекулы При резонансном переносе энергии флуоресценции молекула помечена (по крайней мере) в двух местах. Лазерный луч фокусируется на молекуле, возбуждающей первый зонд. Когда этот зонд расслабляется и испускает фотон, у него появляется шанс возбудить другой зонд. Эффективность поглощения фотона, испущенного из первого зонда, во втором зонде зависит от расстояния между этими зондами. Поскольку расстояние меняется со временем, этот эксперимент исследует внутреннюю динамику молекулы.

По сравнению с ансамблевыми экспериментами

При рассмотрении данных, относящихся к отдельным молекулам, обычно можно построить пропагаторы и функции плотности вероятности скачка времени первого порядка, второго порядка и т. д., тогда как в объемных экспериментах обычно получают затухание корреляционной функции. ^[12] Из информации, содержащейся в этих уникальных функциях (полученных от отдельных молекул), можно получить относительно четкую картину поведения системы; например, его кинетическая схема , или его потенциал активности, или его уменьшенные размеры . ^[13]^[14] В частности, можно построить (многие свойства) путь реакции фермента при мониторинге активности отдельного фермента. ^[15] Кроме того, несколько авторов описали важные аспекты анализа данных об отдельных молекулах, такие как методы подбора и тесты для однородных популяций. ^[9] С другой стороны, существует несколько проблем с анализом данных об отдельных молекулах, включая создание среды с низким уровнем шума и изолированных наконечников пипеток, фильтрацию некоторых оставшихся нежелательных компонентов (шума), обнаруженных в записях, а также продолжительность времени, необходимого для сбора данных. анализ (предварительная обработка, однозначное обнаружение событий, построение графиков данных, подгонка кинетических схем и т. д.).

Влияние

Методы одиночных молекул повлияли на оптику, электронику, биологию и химию. В биологических науках изучение белков и других сложных биологических механизмов ограничивалось ансамблевыми экспериментами, которые практически делали невозможным прямое наблюдение их кинетики. Например, только после того, как флуоресцентная микроскопия одиночных молекул была использована для изучения пар кинезин-миозин в мышечной ткани, стало понятно прямое наблюдение за механизмами ходьбы. Однако эти эксперименты по большей части ограничивались исследованиями in vitro, поскольку полезные методы визуализации живых клеток еще не полностью реализованы. Перспективы визуализации одиночных молекул in vivo, ^[16] однако это дает огромный потенциал для непосредственного наблюдения биомолекул в естественных процессах. Эти методы часто нацелены на исследования белков с низким содержанием копий, многие из которых все еще обнаруживаются. Эти методы также были распространены на изучение областей химии, включая картографирование гетерогенных поверхностей. ^[17]

См. также

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^б Ройтер В., Минко С. (2005). «Эксперименты с одиночными молекулами АСМ на границе твердого тела и жидкости: конформация адсорбированных гибких полиэлектролитных цепей in situ». Журнал Американского химического общества . 127 (45): 15688–15689. дои : 10.1021/ja0558239 . ПМИД 16277495 .
^ Джуэтт М.Ф., Терри Д.С., Вассерман М.Р., Чжоу З., Альтман Р.Б., Чжэн К., Бланшар СК (июнь 2014 г.). «Светлое будущее флуоресцентной визуализации одиночных молекул» . Curr Opin Chem Biol . 20 : 103–111. дои : 10.1016/j.cbpa.2014.05.010 . ПМЦ 4123530 . ПМИД 24956235 .
^ WE Moerner и L. Kador, Оптическое обнаружение и спектроскопия одиночных молекул в твердом теле , Phys. Преподобный Летт. 62, 2535 - 2538 (1989)
^ М. Оррит и Дж. Бернард, Одиночные молекулы пентацена, обнаруженные с помощью возбуждения флуоресценции в кристалле п -терфенила , Phys. Преподобный Летт. 65, 2716–2719 (1990)
^ Кнейпп, Катрин ; Ван, Ян; Кнейпп, Харальд; Перельман Лев Т.; Ицкан, Ирвинг; Дасари, Рамачандра Р.; Фельд, Майкл С. (3 марта 1997 г.). «Обнаружение одиночных молекул с использованием поверхностно-усиленного комбинационного рассеяния (SERS)» . Письма о физических отзывах . 78 (9): 1667–1670. doi : 10.1103/PhysRevLett.78.1667 . ISSN 0031-9007 .
^ Не, Шуминг; Эмори, Стивен Р. (21 февраля 1997 г.). «Исследование одиночных молекул и одиночных наночастиц с помощью поверхностно-усиленного комбинационного рассеяния» . Наука . 275 (5303): 1102–1106. дои : 10.1126/science.275.5303.1102 . ISSN 0036-8075 .
^ Jump up to: ^а ^б Муругесапиллай Д. и др. (2014). «Соединение ДНК и образование петель с помощью HMO1 обеспечивает механизм стабилизации безнуклеосомного хроматина» . Нуклеиновые кислоты Рез . 42 (14): 8996–9004. дои : 10.1093/nar/gku635 . ПМЦ 4132745 . ПМИД 25063301 .
^ Jump up to: ^а ^б Муругесапиллай Д. и др. (2016). «Одномолекулярные исследования высокомобильных белков, изгибающих архитектурную ДНК группы В» . Биофиз Рев . 9 (1): 17–40. дои : 10.1007/s12551-016-0236-4 . ПМЦ 5331113 . ПМИД 28303166 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с Б. Сакманн и Э. Неер, Одноканальная запись , ISBN 9780306414190 (1995).
^ Пиконес, А; Кеунг, Э; Тимпе, LC (2001). «Изменение унитарной проводимости в Kir2.1 и в калиевых каналах внутреннего выпрямителя сердца» . Биофиз Дж . 81 (4): 2035–2049. дои : 10.1016/S0006-3495(01)75853-5 . ПМК 1301677 .
^ Подх, Нитеш Кумар; Паливал, Шиталь; Дей, Парта; Дас, Аян; Морджария, Шрути; Мехта, Гунджан (5 ноября 2021 г.). «Визуализация одиночных молекул in vivo на дрожжах: применение и проблемы». Журнал молекулярной биологии . 433 (22): 167250. doi : 10.1016/j.jmb.2021.167250 . ПМИД 34537238 . S2CID 237573437 .
^ О. Фломенбом, Дж. Клафтер и А. Сабо, Чему можно научиться из траекторий одиночных молекул с двумя состояниями? Архивировано 14 января 2012 года в Wayback Machine , Biophys. Дж. 88, 3780–3783 (2005) ; arXiv : q-bio/0502006
^ О. Фломенбом и Р. Дж. Силби, Использование информационного содержания в траекториях с двумя состояниями. Архивировано 14 января 2012 г., в Wayback Machine , Proc. Натл. акад. наук. США 103, 10907–10910 (2006) .
^ О. Фломенбом и Р. Дж. Силби, «Инструментарий для анализа конечных траекторий с двумя состояниями», Phys. Ред. Е 78, 066105 (2008) ; arXiv:0802.1520 .
^ О. Фломенбом, К. Велония, Д. Лоос и др., Растянутое экспоненциальное затухание и корреляции в каталитической активности колеблющихся одиночных молекул липазы. Архивировано 14 января 2012 г., в Wayback Machine , Proc. Натл. акад. наук. США 102, 2368–2372 (2005) .
^ Чжан, Хун; Станчаускас, Рамунас; Стиглохер, Кристиан; Кеомани-Дизон, Кевин; Жоспен, Маэль; Бессеро, Жан-Луи; Пино, Фабьен (2014). «Визуализация одиночных молекул in vivo выявляет измененную динамику кальциевых каналов у дистрофин-мутантного C. elegans» . Природные коммуникации . 5 : ncomms5974. Бибкод : 2014NatCo...5.4974Z . дои : 10.1038/ncomms5974 . ПМК 4199201 . ПМИД 25232639 .
^ Уолдер, Р.; Нельсон, Н.; Шварц, ДК (2011). «Картирование поверхности сверхвысокого разрешения с использованием траекторий молекулярных зондов» . Природные коммуникации . 2 : 515. Бибкод : 2011NatCo...2..515W . дои : 10.1038/ncomms1530 . ПМИД 22044994 .

[RoiterMinko2005-1] Jump up to: ^а ^б Ройтер В., Минко С. (2005). «Эксперименты с одиночными молекулами АСМ на границе твердого тела и жидкости: конформация адсорбированных гибких полиэлектролитных цепей in situ». Журнал Американского химического общества . 127 (45): 15688–15689. дои : 10.1021/ja0558239 . ПМИД 16277495 .

[2] Джуэтт М.Ф., Терри Д.С., Вассерман М.Р., Чжоу З., Альтман Р.Б., Чжэн К., Бланшар СК (июнь 2014 г.). «Светлое будущее флуоресцентной визуализации одиночных молекул» . Curr Opin Chem Biol . 20 : 103–111. дои : 10.1016/j.cbpa.2014.05.010 . ПМЦ 4123530 . ПМИД 24956235 .

[3] WE Moerner и L. Kador, Оптическое обнаружение и спектроскопия одиночных молекул в твердом теле , Phys. Преподобный Летт. 62, 2535 - 2538 (1989)

[4] М. Оррит и Дж. Бернард, Одиночные молекулы пентацена, обнаруженные с помощью возбуждения флуоресценции в кристалле п -терфенила , Phys. Преподобный Летт. 65, 2716–2719 (1990)

[5] Кнейпп, Катрин ; Ван, Ян; Кнейпп, Харальд; Перельман Лев Т.; Ицкан, Ирвинг; Дасари, Рамачандра Р.; Фельд, Майкл С. (3 марта 1997 г.). «Обнаружение одиночных молекул с использованием поверхностно-усиленного комбинационного рассеяния (SERS)» . Письма о физических отзывах . 78 (9): 1667–1670. doi : 10.1103/PhysRevLett.78.1667 . ISSN 0031-9007 .

[6] Не, Шуминг; Эмори, Стивен Р. (21 февраля 1997 г.). «Исследование одиночных молекул и одиночных наночастиц с помощью поверхностно-усиленного комбинационного рассеяния» . Наука . 275 (5303): 1102–1106. дои : 10.1126/science.275.5303.1102 . ISSN 0036-8075 .

[doigku635-7] Jump up to: ^а ^б Муругесапиллай Д. и др. (2014). «Соединение ДНК и образование петель с помощью HMO1 обеспечивает механизм стабилизации безнуклеосомного хроматина» . Нуклеиновые кислоты Рез . 42 (14): 8996–9004. дои : 10.1093/nar/gku635 . ПМЦ 4132745 . ПМИД 25063301 .

[pmc5331113-8] Jump up to: ^а ^б Муругесапиллай Д. и др. (2016). «Одномолекулярные исследования высокомобильных белков, изгибающих архитектурную ДНК группы В» . Биофиз Рев . 9 (1): 17–40. дои : 10.1007/s12551-016-0236-4 . ПМЦ 5331113 . ПМИД 28303166 .

[SakmannNeher1995-9] Jump up to: ^а ^б ^с Б. Сакманн и Э. Неер, Одноканальная запись , ISBN 9780306414190 (1995).

[Picones-10] Пиконес, А; Кеунг, Э; Тимпе, LC (2001). «Изменение унитарной проводимости в Kir2.1 и в калиевых каналах внутреннего выпрямителя сердца» . Биофиз Дж . 81 (4): 2035–2049. дои : 10.1016/S0006-3495(01)75853-5 . ПМК 1301677 .

[11] Подх, Нитеш Кумар; Паливал, Шиталь; Дей, Парта; Дас, Аян; Морджария, Шрути; Мехта, Гунджан (5 ноября 2021 г.). «Визуализация одиночных молекул in vivo на дрожжах: применение и проблемы». Журнал молекулярной биологии . 433 (22): 167250. doi : 10.1016/j.jmb.2021.167250 . ПМИД 34537238 . S2CID 237573437 .

[12] О. Фломенбом, Дж. Клафтер и А. Сабо, Чему можно научиться из траекторий одиночных молекул с двумя состояниями? Архивировано 14 января 2012 года в Wayback Machine , Biophys. Дж. 88, 3780–3783 (2005) ; arXiv : q-bio/0502006

[13] О. Фломенбом и Р. Дж. Силби, Использование информационного содержания в траекториях с двумя состояниями. Архивировано 14 января 2012 г., в Wayback Machine , Proc. Натл. акад. наук. США 103, 10907–10910 (2006) .

[14] О. Фломенбом и Р. Дж. Силби, «Инструментарий для анализа конечных траекторий с двумя состояниями», Phys. Ред. Е 78, 066105 (2008) ; arXiv:0802.1520 .

[15] О. Фломенбом, К. Велония, Д. Лоос и др., Растянутое экспоненциальное затухание и корреляции в каталитической активности колеблющихся одиночных молекул липазы. Архивировано 14 января 2012 г., в Wayback Machine , Proc. Натл. акад. наук. США 102, 2368–2372 (2005) .

[16] Чжан, Хун; Станчаускас, Рамунас; Стиглохер, Кристиан; Кеомани-Дизон, Кевин; Жоспен, Маэль; Бессеро, Жан-Луи; Пино, Фабьен (2014). «Визуализация одиночных молекул in vivo выявляет измененную динамику кальциевых каналов у дистрофин-мутантного C. elegans» . Природные коммуникации . 5 : ncomms5974. Бибкод : 2014NatCo...5.4974Z . дои : 10.1038/ncomms5974 . ПМК 4199201 . ПМИД 25232639 .

[17] Уолдер, Р.; Нельсон, Н.; Шварц, ДК (2011). «Картирование поверхности сверхвысокого разрешения с использованием траекторий молекулярных зондов» . Природные коммуникации . 2 : 515. Бибкод : 2011NatCo...2..515W . дои : 10.1038/ncomms1530 . ПМИД 22044994 .

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]

[15]

[16]

[17]