Движение связанных частиц

Движение связанных частиц ( TPM ) — это биофизический метод, который используется для изучения различных полимеров, таких как ДНК , и их взаимодействия с другими объектами, такими как белки .

ТПМ – шарик диффундирует в растворе, но из-за привязки может двигаться только в ограниченном объеме.

Этот метод позволяет наблюдателям измерять различные физические свойства веществ, а также измерять свойства биохимических взаимодействий с другими веществами, такими как белки и ферменты.TPM — это метод эксперимента с одной молекулой .

История

TPM был впервые представлен Шафером, Геллесом, Шицем и Ландиком в 1991 году. В своих исследованиях они прикрепили к поверхности РНК-полимеразу , а к одному концу молекул ДНК прикрепили золотые шарики. Вначале РНК-полимераза «захватывает» ДНК возле золотой бусины. Во время транскрипции ДНК «скользит» по РНК-полимеразе, поэтому расстояние между РНК-полимеразой и золотым шариком (длина привязи) увеличивается. С помощью оптического микроскопа была обнаружена область, в которой движется шарик. Скорость транскрипции была извлечена из данных.
С тех пор было проведено множество экспериментов с ТРМ, и метод был улучшен во многих отношениях, таких как типы шариков, биохимические методы, визуализация (более быстрые камеры, различные методы микроскопии и т. д.), анализ данных и сочетание с другими методами работы с одиночными молекулами ( например, оптический или магнитный пинцет).

Принцип метода

Один конец полимера прикреплен к небольшому шарику (десятки-сотни нанометров), а другой конец прикреплен к поверхности.И полимер, и шарик остаются в водной среде, поэтому шарик движется по броуновскому движению . Из-за троса движение ограничено. Используя оптический микроскоп и ПЗС-камеру , можно отслеживать положение шариков во временном ряду. Хотя размер шарика обычно меньше дифракционного предела , поэтому изображение представляет собой пятно, которое больше самого шарика ( функция рассеяния точки ), центр пятна представляет собой проекцию на плоскость XY конца полимера ( конец -конечный вектор ). Анализ распределения положения шариков может дать нам много информации о полимере.

Моделирование ТРМ . Моделирование выполнено в MATLAB с использованием свободносоединенной цепи модели полимеров . Зеленые точки представляют собой проекцию сквозного вектора полимера на плоскость XY.

Номер экскурсии

Для того чтобы в движении преобладал полимер, а не шарики, следует заметить, что число отклонения N _R , будет меньше 1:

$N_{R}\equiv {\frac {r}{\sqrt {L\cdot {l_{p}/3}}}}<1$

где $r$ - радиус буртика, $L$ – контурная длина полимера и $l_{p}$ – длина персистентности (50 нм в физиологических условиях) полимера. (Можно работать и тогда, когда $N_{R}>1$, но относиться к нему следует осторожно.)

Типы бисера

Металлические бусины (обычно золотые) рассеивают свет с высокой интенсивностью, поэтому можно использовать очень маленькие бусины (диаметром около 40 нм) и при этом получать хорошее изображение. С другой стороны, металлические бусины не являются подходящим инструментом для экспериментов с оптическим пинцетом .

Гранулы полистирола рассеивают свет слабее, чем металлические (чтобы получить такую ​​же интенсивность, как при получении золотой бусины толщиной 40 нм, гранула полистирола должна иметь толщину ~125 нм! ), но у него есть то преимущество, что его можно комбинировать с экспериментами с оптическим пинцетом.

Основное преимущество флуоросфер заключается в том, что длина волны возбуждения и длина волны излучения не совпадают, поэтому можно использовать дихроичный фильтр для получения более чистого сигнала. Недостатком флуоросфер является фотообесцвечивание .

Все типы и диаметры шариков (с биохимическим маркером, см. раздел сборки троса) производятся коммерческими компаниями, и их можно легко приобрести.

Сборка чипа и троса

Сборка чипа

Чип можно сделать из двух покровных стекол. В одном из них необходимо просверлить два отверстия, позволяющие вводить реагенты в проточную ячейку. Слайды следует очистить от грязи. Для этого подойдет ультразвуковая ванночка, 15 минут в изопропаноле должны помочь. Далее следует создать канал. Один из способов сделать это — разрезать парафильм по центру, оставив рамку из парафильма, которая будет использоваться в качестве прокладки между слайдами. Слайды следует соединить друг с другом, расположив между ними разрезанный парафильм. Последний шаг — нагреть чип, чтобы парафильм расплавился и склеил слайды.

Сборка троса

Во-первых, чип необходимо пассивировать, чтобы полимер не прилипал к стеклу, существует множество блокирующих реагентов (БСА, альфа-казеин и т. д.), и нужно найти то, что лучше всего подходит для конкретной ситуации.Затем поверхность должна быть покрыта антителом или другой реактивной молекулой (например, антидигоксигенином ) , которая будет связываться с антигеном ( дигоксигенином ) на одном конце полимера. После инкубации в течение примерно 45 минут избыток антител необходимо смыть.После отмывки излишков антител полимер следует ввести в чип и инкубировать примерно такое же время. Полимер ранее был модифицирован на концах. На одном конце имеется биотиновый хвост, а на другом — дигоксигениновый хвост. После инкубации несвязавшийся полимер необходимо вымыть из клетки. Затем . в проточную ячейку следует ввести шарики, покрытые антибиотиком, и инкубировать их в течение примерно 30–45 минут Лишние бусины следует смыть.

Анализ данных

Duration: 17 seconds.0:17

Видео снято из эксперимента TPM с использованием темнопольного микроскопа. Бусины в зеленой оправе — это связанные бусины, а в красной — иммобилизованные бусины.

Отслеживание

Как упоминалось выше, на изображении показана не сама бусинка, а более крупное пятно в соответствии с ее PSF ( функция распределения точки ). Кроме того, размер пикселя камеры может снизить разрешение измерения.Чтобы определить точное положение бусины (которое соответствует сквозному вектору), центр пятна должен быть найден как можно точнее. Это можно сделать с хорошим разрешением, используя два разных метода, оба основанные на характеристиках пятна. Интенсивность света в фокальной плоскости распределена как диск Эйра и имеет круговую симметрию.

Двумерная функция Гаусса является хорошим приближением для диска Эйри . Подгоняя эту функцию к месту, можно найти параметры $x_{0}$ и $y_{0}$ это координаты центра пятна и сквозного вектора.

Второй метод – найти центр интенсивности, используя определение центра масс :

${\vec {R}}_{cm}={\frac {1}{I_{tot}}}\cdot \sum _{k=1}^{N}I_{k}\cdot {\vec {r}}_{k}$

где ${\vec {R}}_{cm}$ – координата центра масс, $\textstyle I_{tot}$ - полная интенсивность пятна, а $\textstyle I_{k}$ и $\textstyle {\vec {r}}_{k}$ — интенсивность и координата k -го пикселя. Из-за круговой симметрии координата центра интенсивности является координатой центра бусины.
Оба метода дают нам координату сквозного вектора с разрешением, лучшим, чем размер пикселя.

Дрейф TPM: вверху: Зеленый график — данные эксперимента TPM, черная кривая — сглаживание данных (дрейф). внизу: вычитание дрейфа из данных.

Коррекция дрейфа

Обычно вся система дрейфует во время измерения. Существует несколько методов исправления дрейфа, в целом их можно разделить на 3 группы:

Частота броуновского движения намного больше частоты дрейфа, поэтому можно использовать фильтр верхних частот для устранения дрейфа . Аналогичного эффекта можно добиться сглаживанием данных и вычитанием сглаженных данных из данных (см. рисунок).

Если в кадре показано несколько бусинок, поскольку каждая бусинка движется случайным образом, усреднение по их положению для каждого кадра должно дать нам смещение (его следует вычесть из данных, чтобы получить чистые данные).

Если в кадре показана иммобилизованная бусина, мы можем принять ее положение за эталон и скорректировать данные по положению иммобилизованной бусины. (Еще одним преимуществом наблюдения за неподвижной бусиной является тот факт, что ее движение может сказать нам о точности измерения.)
Конечно, можно использовать более одного метода.

Характеристика полимера

Обычно статистика случайного блуждания соответствует сквозному вектору полимера. Для 1-мерного распределения мы получим нормальное распределение , а для 2-мерного — распределение Рэлея :

$P_{1D}(x)dx={\sqrt {\frac {3}{4{\pi }Ll_{p}}}}\exp {\left(-{\frac {3x^{2}}{4Ll_{p}}}\right)}dx\,\,\,;\,\,\,\,\,\,P_{2D}(R)dR=2{\pi }R{\frac {3}{4{\pi }Ll_{p}}}\exp {\left(-{\frac {3R^{2}}{4Ll_{p}}}\right)}dR$

где $L$ длина контура и $l_{p}$ - это длина персистентности.
После сбора данных временных рядов необходимо подогнать гистограмму данных к функции распределения (одномерной или двумерной). Если контурная длина полимера известна, единственным подходящим параметром является длина послесвечения.

Пружинная константа

Благодаря энтропийной силе полимер действует как пружина Гука. Согласно распределению Больцмана , распределение пропорционально показателю степени отношения упругой энергии к тепловой энергии :

$P(x)\propto \exp {\left(-{\frac {{\frac {1}{2}}kx^{2}}{K_{B}T}}\right)}$

где $k$ - пружинная константа , $K_{B}$ постоянная Больцмана и $T$ это температура. Логарифмируя ​ распределение $P(x)$ и придав ему форму параболы , можно получить жесткость пружины полимера:

$\displaystyle k=2{\alpha }K_{B}T$

где $\alpha$ коэффициент $x^{2}$ из соответствия параболе.

Преимущество и недостаток

Преимущества включают в себя простоту установки, стоимость, тот факт, что наблюдения проводятся в естественной среде полимера (никакие внешние силы не используются), он подходит для различных методов микроскопии (например, TIRFM , темнопольная микроскопия , дифференциально-интерференционная контрастная микроскопия и т. д.), его можно комбинировать и манипулировать им, используя другие методы, и существует множество вариантов применения. К недостаткам можно отнести низкое пространственное разрешение (~30 нм) и то, что он подходит in vitro . только для экспериментов

См. также

• Отслеживание одной частицы
• Одномолекулярный эксперимент