Магнитные пинцеты

Магнитные пинцеты (МТ) — это научные инструменты для манипулирования и определения характеристик биомолекул или полимеров . Эти устройства оказывают силы и крутящие моменты на отдельные молекулы или группы молекул. Его можно использовать для измерения прочности на разрыв или силы, создаваемой молекулами.

Чаще всего магнитный пинцет используется для изучения механических свойств биологических макромолекул, таких как ДНК или белки, в экспериментах с одиночными молекулами . Другими приложениями являются реология мягкой материи и исследование процессов, регулируемых силой, в живых клетках. Силы обычно имеют порядок от пико- до наноньютонов (от pN до nN). Благодаря своей простой конструкции магнитные пинцеты являются популярным биофизическим инструментом.

В экспериментах интересующую молекулу прикрепляют к магнитной микрочастице. Магнитный пинцет оснащен магнитами, которые используются для манипулирования магнитными частицами, положение которых измеряется с помощью видеомикроскопии.

Принцип устройства и физика магнитного пинцета.

Аппарат магнитный пинцет состоит из магнитных микрочастиц, которыми можно манипулировать с помощью внешнего магнитного поля. Положение магнитных частиц затем определяется микроскопическим объективом с камерой.

Типичная конфигурация магнитного пинцета; показан только экспериментальный объем.

Магнитные частицы

Магнитные частицы для работы в магнитных пинцетах обладают широким спектром свойств и должны выбираться в соответствии с предполагаемым применением. В следующих параграфах описаны два основных типа магнитных частиц; однако есть и другие, такие как магнитные наночастицы в феррожидкостях , которые позволяют проводить эксперименты внутри клетки.

Суперпарамагнитные шарики

Суперпарамагнитные шарики коммерчески доступны с рядом различных характеристик. Наиболее распространенным является использование сферических частиц диаметром микрометрового диапазона. Они состоят из пористой латексной матрицы, в которую внедрены магнитные наночастицы. Латекс автофлуоресцентен и поэтому может быть полезен для визуализации их положения. Частицы неправильной формы имеют большую поверхность и, следовательно, более высокую вероятность связывания с изучаемыми молекулами. Покрытие микрошариков также может содержать лиганды, способные присоединять интересующие молекулы. Например, покрытие может содержать стрептавидин , который прочно связывается с биотином , который сам может быть связан с интересующими молекулами.

Под воздействием внешнего магнитного поля эти микрошарики намагничиваются. Индуцированный магнитный момент ${\overrightarrow {m}}({\overrightarrow {B}})$ пропорциональна слабому внешнему магнитному полю ${\overrightarrow {B}}$:

${\overrightarrow {m}}({\overrightarrow {B}})={\frac {V\chi {\overrightarrow {B}}}{\mu _{0}}}$

где $\mu _{0}$ это вакуумная проницаемость . Он также пропорционален объему $V$ микросфер , что связано с тем , что количество магнитных наночастиц зависит от размера шарика. Магнитная восприимчивость $\chi$ в этой первой оценке предполагается скалярным и может быть рассчитано по формуле $\chi =3{\frac {\mu _{r}-1}{\mu _{r}+2}}$, где $\mu _{r}$ это относительная проницаемость . В сильном внешнем поле индуцированный магнитный момент насыщается при значении, зависящем от материала. ${\overrightarrow {m}}_{sat}$. Сила ${\overrightarrow {F}}$ испытываемый микрошариками, может быть получен из потенциального $U=-{\frac {1}{2}}{\overrightarrow {m}}({\overrightarrow {B}})\cdot {\overrightarrow {B}}$ этого магнитного момента во внешнем магнитном поле:

${\overrightarrow {F}}=-{\overrightarrow {\nabla }}U={\begin{cases}{\frac {V\chi }{2\mu _{0}}}{\overrightarrow {\nabla }}\left|{\overrightarrow {B}}\right|^{2}&\qquad {\text{in a weak magnetic field}}\\{\frac {1}{2}}{\overrightarrow {\nabla }}\left({\overrightarrow {m}}_{sat}\cdot {\overrightarrow {B}}\right)&\qquad {\text{in a strong magnetic field}}\end{cases}}$

Внешнее магнитное поле можно оценить численно с помощью анализа методом конечных элементов или просто измерить магнитное поле с помощью датчика Холла . Теоретически можно было бы рассчитать силу, действующую на бусинки, по этим формулам; однако результаты не очень надежны из-за неопределенности задействованных переменных, но они позволяют оценить порядок величин и помогают лучше понять систему. Более точные численные значения можно получить, рассматривая броуновское движение шариков.

Из-за анизотропии стохастического распределения наночастиц внутри микрошарика магнитный момент не идеально согласован с внешним магнитным полем, т.е. тензор магнитной восприимчивости не может быть сведен к скаляру. По этой причине буртики также подвергаются крутящему моменту. ${\overrightarrow {\Gamma }}$который пытается выровнять ${\overrightarrow {m}}$ и ${\overrightarrow {B}}$:

${\overrightarrow {\Gamma }}={\overrightarrow {m}}\times {\overrightarrow {B}}$

Крутящие моменты, создаваемые этим методом, обычно намного превышают $10^{3}\mathrm {pNnm}$, что более чем необходимо для скручивания интересующих молекул.

Ферромагнитные нанопровода

Использование ферромагнитных нанопроволок для работы магнитных пинцетов расширяет диапазон их экспериментального применения. Длина этих проводов обычно составляет от десятков нанометров до десятков микрометров, что намного превышает их диаметр. По сравнению с суперпарамагнитными шариками они позволяют применять гораздо большие силы и моменты. Кроме того, они представляют собой остаточный магнитный момент. Это позволяет работать в слабых магнитных полях. Можно производить нанопроволоки с сегментами поверхности, имеющими разные химические свойства, что позволяет контролировать положение, в котором исследуемые молекулы могут связываться с проволокой.

Магниты

Чтобы иметь возможность прикладывать крутящий момент к микрошарикам, необходимы как минимум два магнита, но было реализовано множество других конфигураций: от одного магнита, который только притягивает магнитные микрошарики, до системы из шести электромагнитов, которая позволяет полностью контролировать трехмерное положение. и вращение через цифровую петлю обратной связи . Напряженность магнитного поля уменьшается примерно экспоненциально с расстоянием от оси, соединяющей два магнита, в типичном масштабе, примерно равном ширине зазора между магнитами. Поскольку этот масштаб достаточно велик по сравнению с расстояниями, при движении микрошарика в эксперименте силу, действующую на него, можно считать постоянной. Таким образом, магнитные пинцеты по своей конструкции являются пассивными силовыми зажимами в отличие от оптических пинцетов, хотя в сочетании с петлей обратной связи их можно использовать и в качестве положительных зажимов. Напряженность поля можно увеличить заострением полюсной поверхности магнита, что, однако, также уменьшает область, где поле можно считать постоянным. Железное кольцо, соединяющее внешние полюса магнитов, может помочь уменьшить поля рассеяния. Магнитные пинцеты могут работать как с постоянными магнитами, так и с электромагнитами. Оба метода имеют свои особые преимущества.

Постоянные магниты

Постоянные магниты магнитных пинцетов обычно изготавливаются из редкоземельных материалов, таких как неодим , и могут достигать напряженности поля, превышающей 1,3 Тесла. Усилие, действующее на шарики, можно контролировать путем перемещения магнитов вдоль вертикальной оси. Перемещение их вверх уменьшает напряженность поля в положении шарика и наоборот. Крутящие моменты на магнитных шариках можно создавать путем поворота магнитов вокруг вертикальной оси для изменения направления поля. Размер магнитов составляет порядка миллиметров, а также расстояние между ними.

Электромагниты

Преимущество использования электромагнитов в магнитных пинцетах заключается в том, что напряженность и направление поля можно изменять, просто регулируя амплитуду и фазу тока магнитов. По этой причине магниты не нужно перемещать, что позволяет быстрее управлять системой и снижает механический шум. Для увеличения максимальной напряженности поля сердечник из мягкого парамагнитного материала с высоким насыщением и низкой остаточной намагниченностью в соленоид может быть добавлен . Однако в любом случае типичная напряженность поля намного ниже, чем у постоянных магнитов сопоставимого размера. Кроме того, использование электромагнитов требует больших токов, которые выделяют тепло, что может потребовать установки системы охлаждения.

Система отслеживания шариков

Смещение магнитных шариков соответствует реакции системы на наложенное магнитное поле и, следовательно, должно быть точно измерено: в типичной установке экспериментальный объем освещается сверху, так что шарики создают дифракционные кольца в фокальная плоскость объектива, расположенного под привязывающей поверхностью. Затем дифракционная картина регистрируется CCD-камерой . Изображение может быть проанализировано в режиме реального времени с помощью компьютера. Определение положения в плоскости привязывающей поверхности не представляет сложности, поскольку оно соответствует центру дифракционных колец. Точность может достигать нескольких нанометров. Для положения по вертикальной оси дифракционную картину необходимо сравнить с эталонными изображениями, на которых представлена ​​дифракционная картина рассматриваемого шарика на ряде известных расстояний от фокальной плоскости. Эти калибровочные изображения получаются путем удерживания бусины фиксированной при перемещении объектива, т.е. фокальной плоскости, с помощью пьезоэлектрических элементов на известные расстояния. С помощью интерполяции разрешение может достигать точности до 10 нм по этой оси. Полученные координаты можно использовать в качестве входных данных для цифрового контура обратной связи, который управляет силой магнитного поля, например, для того, чтобы удерживать шарик в определенном положении.

Немагнитные шарики обычно также добавляются к образцу в качестве эталона для определения вектора смещения фона. Они имеют другой диаметр, чем магнитные шарики, поэтому их можно различить оптически. Это необходимо для обнаружения потенциального дрейфа жидкости. Например, если плотность магнитных частиц слишком высока, они могут увлечь за собой окружающую вязкую жидкость. Вектор смещения магнитного шарика можно определить путем вычитания вектора его начального положения и вектора фонового смещения из его текущего положения.

Принудительная калибровка

Определение силы, действующей на магнитные шарики со стороны магнитного поля, можно рассчитать, учитывая тепловые колебания шарика в горизонтальной плоскости: Задача вращательно-симметрична относительно вертикальной оси; в дальнейшем одно произвольно выбранное направление в плоскости симметрии называется $x$. Анализ одинаков для направления, ортогонального направлению x, и может использоваться для повышения точности. Если бусинка выйдет из положения равновесия на $x$-ось по $\delta x$ из-за тепловых колебаний на него будет действовать восстанавливающая сила $F_{\chi }$ которая возрастает линейно с $\delta x$ в первом приближении. Учитывая только абсолютные значения задействованных векторов, геометрически ясно, что константа пропорциональности — это сила, действующая со стороны магнитов. $F$ по длине $l$ молекулы, которая удерживает шарик на привязывающей поверхности:

Геометрия сил, действующих на магнитный шарик.

$F_{\chi }={\frac {F}{l}}\delta x$.

Теорема о равнораспределении утверждает, что средняя энергия, запасенная в этой «пружине», равна ${\frac {1}{2}}k_{B}T$ на каждую степень свободы. Поскольку здесь рассматривается только одно направление, потенциальная энергия системы равна: $\langle E_{p}\rangle ={\frac {1}{2}}{\frac {F}{l}}\langle \delta x^{2}\rangle ={\frac {1}{2}}k_{B}T$.Отсюда можно сделать первую оценку силы, действующей на борт:

$F={\frac {lk_{B}T}{\langle \delta x^{2}\rangle }}$.

Однако для более точной калибровки необходим анализ в пространстве Фурье. Спектральная плотность мощности $P(\omega )$ Положение шарика доступно экспериментально. Ниже получено теоретическое выражение для этого спектра, которое затем можно подогнать к экспериментальной кривой, чтобы получить силу, действующую со стороны магнитов на шарик, в качестве подгоночного параметра. По определению этот спектр представляет собой квадрат модуля преобразования Фурье положения $X(\omega )$ по спектральной полосе пропускания $\Delta f$:

$P(\omega )={\frac {\left|X(\omega )\right|^{2}}{\Delta f}}$

$X(\omega )$ можно получить, рассматривая уравнение движения шарика массой $m$:

$m{\frac {\partial ^{2}x(t)}{\partial t^{2}}}=-6\pi R\eta {\frac {\partial x(t)}{\partial t}}-{\frac {F}{l}}x(t)+f(t)$

Термин $6\pi R\eta {\frac {\partial x(t)}{\partial t}}$ соответствует силе трения Стокса для сферической частицы радиуса $R$ в среде вязкости $\eta$ и ${\frac {F}{l}}x(t)$ восстанавливающая сила, противостоящая стохастической силе $f(t)$ из-за броуновского движения. Здесь можно пренебречь инерционным членом $m{\frac {\partial ^{2}x(t)}{\partial t^{2}}}$, поскольку система находится в режиме очень малого числа Рейнольдса $\left(\mathrm {Re} <10^{-5}\right)$.

Уравнение движения можно преобразовать Фурье, вставив движущую силу и положение в пространство Фурье:

${\begin{aligned}f(t)=&{\frac {1}{2\pi }}\int F(\omega )\mathrm {e} ^{i\omega t}\mathrm {d} t\\x(t)=&{\frac {1}{2\pi }}\int X(\omega )\mathrm {e} ^{i\omega t}\mathrm {d} t.\end{aligned}}$

Это приводит к:

$X(\omega )={\frac {F(\omega )}{6\pi iR\eta \omega +{\frac {F}{l}}}}$.

Спектральная плотность мощности стохастической силы $F(\omega )$ можно получить, используя теорему о равнораспределении и тот факт, что броуновские столкновения совершенно некоррелированы:

${\frac {\left|F(\omega )\right|^{2}}{\Delta f}}=4k_{B}T\cdot 6\pi \eta R$

Это соответствует теореме о флуктуации-диссипации . С помощью этого выражения можно дать теоретическое выражение спектра мощности:

$P(\omega )={\frac {24\pi k_{B}T\eta R}{36\pi ^{2}R^{2}\eta ^{2}\omega ^{2}+\left({\frac {F}{l}}\right)^{2}}}$

Единственное неизвестное в этом выражении, $F$, можно определить, подобрав это выражение к экспериментальному спектру мощности. Для получения более точных результатов перед подгонкой можно вычесть эффект, обусловленный конечным временем интеграции камеры, из экспериментального спектра.

Другой метод калибровки силы заключается в использовании вязкого сопротивления микрошариков: поэтому микрошарики протягиваются через вязкую среду, одновременно фиксируя их положение. Поскольку число Рейнольдса для системы очень мало, можно применить закон Стокса для расчета силы трения, которая находится в равновесии с силой, действующей со стороны магнитов:

$F=6\pi \eta Rv$.

Скорость $v$ можно определить, используя записанные значения скорости. Силу, полученную по этой формуле, можно затем связать с заданной конфигурацией магнитов, что может служить калибровкой.

Типичная экспериментальная установка

Схематические кривые торсионного растяжения ДНК при различных силах в диапазоне пико Ньютона.

В этом разделе приведен пример эксперимента, проведенного Стриком, Аллемандом, Крокеттом. с помощью магнитного пинцета. Молекула двухцепочечной ДНК фиксируется с помощью нескольких участков связывания на одном конце к стеклянной поверхности, а на другом - к магнитным микрошарикам, которыми можно манипулировать с помощью магнитного пинцета. Поворачивая магниты, к молекуле ДНК можно приложить торсионное напряжение. Вращения в смысле спирали ДНК считаются положительными и наоборот. Магнитный пинцет при скручивании позволяет также растягивать молекулу ДНК. Таким образом, кривые растяжения кручения могут быть записаны при различных силах растяжения. При малых силах (менее 0,5 пН) ДНК образует суперспирали, так называемые плектонемы, которые уменьшают растяжение молекулы ДНК совершенно симметрично при положительных и отрицательных поворотах. Увеличение тяговой силы уже увеличивает растяжение при нулевом кручении. Положительные повороты снова приводят к образованию плектонем, уменьшающих растяжение. Однако отрицательный поворот не сильно меняет удлинение молекулы ДНК. Это можно интерпретировать как разделение двух нитей, соответствующее денатурация молекулы. В режиме высоких сил растяжение практически не зависит от приложенного скручивающего напряжения. Интерпретация заключается в появлении локальных участков сильно перекрученной ДНК. Важным параметром этого эксперимента также является ионная сила раствора, которая влияет на критические значения приложенной силы растяжения, разделяющей три силовых режима.

История и развитие

Крик в Кембриджском университете

Применение магнитной теории к изучению биологии — это биофизический метод, который начал появляться в Германии в начале 1920-х годов. Возможно, первая демонстрация была опубликована Альфредом Хайльбронном в 1922 году; касалась вязкости протопластов . его работа В следующем году Фрейндлих и Зейфриц исследовали реологию яиц иглокожих . Оба исследования включали введение магнитных частиц в клетки и результирующие наблюдения за движением в магнитного поля градиенте .

Доктор Фелл в своей лаборатории в Кембридже, 1950-е годы.

В 1949 году в Кембриджском университете Фрэнсис Крик и Артур Хьюз продемонстрировали новое использование этой техники, назвав ее «Метод магнитных частиц». Идея, первоначально исходившая от доктора Хонор Фелла , заключалась в том, что крошечными магнитными шариками, фагоцитируемыми целыми клетками, выращенными в культуре, можно манипулировать с помощью внешнего магнитного поля. клетки, содержащие магнитные частицы, можно было увидеть в микроскоп с большим увеличением. Когда магнитная частица перемещалась через клетку под действием магнитного поля, были проведены измерения физических свойств цитоплазмы . Хотя некоторые из их методов и измерений были, по общему признанию, грубыми, их работа продемонстрировала полезность манипулирования частицами магнитного поля и проложила путь для дальнейшего развития этой техники. Метод магнитопорошкового фагоцитоза продолжал использоваться в течение многих лет для исследования реологии цитоплазмы и других физических свойств целых клеток.

Нововведение 1990-х годов привело к расширению полезности этого метода, аналогично появившемуся в то время методу оптического пинцета . Химическое соединение отдельной молекулы ДНК между магнитной бусиной и предметным стеклом позволило исследователям манипулировать отдельной молекулой ДНК с помощью внешнего магнитного поля. При приложении скручивающих сил к молекуле отклонения от движения свободной формы можно измерить с помощью теоретических стандартных кривых силы или анализа броуновского движения . Это позволило понять структурные и механические свойства ДНК , такие как эластичность .

Магнитный пинцет как экспериментальный метод приобрел исключительное разнообразие в использовании и применении. Совсем недавно были открыты или предложены еще более новые методы. С 2002 года изучается возможность проведения экспериментов с участием множества связывающих молекул и параллельных магнитных шариков, что проливает свет на механику взаимодействия, особенно в случае ДНК-связывающих белков . В 2005 году была опубликована методика, которая включала покрытие магнитной бусины молекулярным рецептором , а предметное стекло - его лигандом . Это позволяет по-новому взглянуть на силу диссоциации рецептора-лиганда. В 2007 году Коллманнсбергер и Фабри разработали новый метод магнитного манипулирования целыми клетками. Этот метод включает в себя прикрепление шариков к внеклеточному матриксу и манипулирование клеткой снаружи мембраны для проверки структурной эластичности. Этот метод продолжает использоваться как средство изучения реологии , а также клеточных структурных белков . В 2013 году появилось исследование, в котором магнитный пинцет использовался для механического измерения раскручивания и перемотки отдельного нейронного комплекса SNARE путем привязывания всего комплекса между магнитной бусинкой и предметным стеклом, а затем использования силы приложенного магнитного поля, чтобы разорвать комплекс на части.

Биологические применения

Реология магнитного пинцета

Магнитный пинцет можно использовать для измерения механических свойств, таких как реология , исследования потока и эластичности вещества в целых клетках. Описанный ранее метод фагоцитоза полезен для захвата магнитного шарика внутри клетки. Измерение движения шариков внутри клетки в ответ на манипуляции со стороны внешнего магнитного поля дает информацию о физической среде внутри клетки и реологии внутренней среды: вязкости цитоплазмы, жесткости внутренней структуры и легкости потока частиц.

Целой клеткой также можно манипулировать с помощью магнита, прикрепив магнитную бусину к внеклеточному матриксу с помощью фибронектином магнитных бусинок, покрытых . Фибронектин представляет собой белок, который связывается с белками внеклеточной мембраны . Этот метод позволяет измерять жесткость клеток и дает представление о функционировании структурных белков. Схема, показанная справа, изображает экспериментальную установку, разработанную Бонакдаром и Шиллингом и др. (2015) для изучения структурного белка плектина в клетках мыши. Жесткость измеряли как пропорциональную положению валика в ответ на внешнее магнитное воздействие.

Одномолекулярные эксперименты

Магнитный пинцет как одномолекулярный метод, безусловно, является наиболее распространенным применением в последние годы. Благодаря методу одиночных молекул молекулярный пинцет позволяет внимательно изучить физические и механические свойства биологических макромолекул . Подобно другим методам исследования одной молекулы, таким как оптический пинцет , этот метод позволяет изолировать отдельную молекулу и манипулировать ею без влияния окружающих молекул. Здесь магнитный шарик прикрепляется к поверхности привязки интересующей молекулой. ДНК или РНК могут быть связаны как в одноцепочечной, так и в двухцепочечной форме, или могут быть связаны целые структурные мотивы, такие как соединения Холлидея ДНК , шпильки ДНК или целые нуклеосомы и хроматин . Воздействуя на магнитный шарик магнитным полем, различные типы крутильной силы для изучения внутри-ДНК-взаимодействий. можно применять а также взаимодействия с топоизомеразами или гистонами в хромосомах .

Однокомплексные исследования

Однако магнитные пинцеты выходят за рамки возможностей других методов одиночных молекул, поскольку также можно наблюдать взаимодействия между комплексами и внутри них. Это позволило добиться недавних успехов в понимании ДНК-связывающих белков , взаимодействий рецептора и лиганда. и расщепление ферментом рестрикции. Более позднее применение магнитных пинцетов наблюдается в однокомплексных исследованиях. С помощью ДНК в качестве связующего агента между шариком и привязывающей поверхностью можно прикрепить целый молекулярный комплекс. Точно так же, как при разрыве шпильки ДНК путем приложения силы к магнитной бусине, можно разделить весь комплекс и измерить силу, необходимую для диссоциации. Это также похоже на метод разделения взаимодействий рецептор-лиганд с помощью магнитного пинцета для измерения силы диссоциации.

Сравнение с другими методами

В этом разделе сравниваются характеристики магнитных пинцетов с характеристиками других наиболее важных экспериментальных методов одиночных молекул: оптических пинцетов и атомно-силовой микроскопии . Магнитное взаимодействие весьма специфично для использованных суперпарамагнитных микрошариков. Магнитное поле практически не влияет на образец. Проблема оптических пинцетов заключается в том, что лазерный луч может также взаимодействовать с другими частицами биологического образца из-за контраста показателя преломления . Кроме того, лазер может вызвать фотоповреждение и нагрев образца. В случае атомно-силовой микроскопии также может быть сложно отличить взаимодействие иглы с изучаемой молекулой от других неспецифических взаимодействий.

Благодаря низкой жесткости ловушки диапазон сил, доступных с помощью магнитного пинцета, ниже по сравнению с двумя другими методами. Возможность приложения крутящего момента с помощью магнитных пинцетов не уникальна: оптические пинцеты также могут обеспечивать эту функцию при работе с двулучепреломляющими микрошариками в сочетании с лазерным лучом с круговой поляризацией.

Еще одним преимуществом магнитного пинцета является то, что с его помощью легко проводить параллельно множество измерений отдельных молекул.

Важным недостатком магнитных пинцетов является низкое временное и пространственное разрешение из-за сбора данных с помощью видеомикроскопии. Однако с добавлением высокоскоростной камеры временное и пространственное разрешение достигло уровня Ангстрема.

Дальнейшее чтение

• Де Вламинк, И.; Деккер, К. (2012). «Последние достижения в области магнитных пинцетов». Ежегодный обзор биофизики . 41 : 453–472. doi : 10.1146/annurev-biophys-122311-100544 . ПМИД   22443989 .