Интеграция ВИЧ

СПИД («синдром приобретенного иммунодефицита») вызывается вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). Лица с ВИЧ имеют так называемую «ВИЧ-инфекцию». Когда инфицированная сперма , вагинальные выделения или кровь вступают в контакт со слизистыми оболочками или поврежденной кожей неинфицированного человека, ВИЧ может передаваться неинфицированному человеку (« горизонтальная передача »), вызывая новую инфекцию. Кроме того, ВИЧ также может передаваться от инфицированной беременной женщины неинфицированному ребенку во время беременности и/или родов (« вертикальная передача ») или при грудном вскармливании . В результате ВИЧ-инфекции у части этих людей прогрессирует и развивается клинически значимый СПИД.

ВИЧ — это ретровирус , который включает в себя большое и разнообразное семейство РНК- вирусов , которые создают ДНК- копию своего РНК- генома после заражения клетки -хозяина . Важным шагом в цикле репликации ВИЧ-1 и других ретровирусов является интеграция этой вирусной ДНК в ДНК хозяина. РНК-геном вирионов-потомков и матрица для трансляции вирусных белков создаются при транскрипции интегрированной вирусной ДНК.

Справочная информация: Интеграза ВИЧ-1

Структурные домены интегразы ВИЧ-1

Интеграция ДНК ВИЧ в ДНК хозяина является критическим шагом в жизненном цикле ВИЧ. Понимание процесса интеграции обеспечит основу для понимания множества потенциальных мест терапевтического вмешательства при ВИЧ-инфекции и СПИДе. Фермент ВИЧ, предназначенный для встраивания ДНК-версии его генома в ДНК клетки-хозяина, называется « интегразой ». Интеграза ВИЧ-1 катализирует действие «вырезать и вставить», заключающееся в отсечении ДНК хозяина и присоединении провирусного генома к обрезанным концам. Этот белок длиной 288 аминокислот содержит три «домена» в следующем порядке: ^{[ нужна ссылка ]}

1. Амино (N)-концевой домен: N-концевой домен, который иногда называют «цинковым пальцем», состоит из консервативных остатков HHCC, His и Cys , мотива, который служит для связывания цинка. Функция N-концевого домена не совсем ясна, но считается, что он помогает интегразе образовывать мультимеры (фиксированные агломерации нескольких молекул интегразы).

2. Центральный каталитический домен (или «каталитическое ядро» ). Каталитическое ядро включает каталитическую триаду DDE аминокислот или кислотных остатков, которые обеспечивают связывание двухвалентного металла (обычно Mg). ²⁺ или Мн ²⁻), образуя активный каталитический центр . В случае интегразы ВИЧ-1 остатки представляют собой Asp64, Asp116 и Glu152. Этот домен также хорошо сохраняется в ходе эволюции.

Каталитический домен ВИЧ-1 выглядит димерным в растворе и в кристаллических структурах. Обширная площадь поверхности интерфейса димера указывает на его биологическую значимость. Сайты вставки на каждой нити целевой ДНК разделены 5 парами оснований , что соответствует примерно 15 Å для спиральной B-формы ДНК, подразумевая, что каталитический домен (или функциональная единица) интегразы должен содержать пару разделенных активных сайтов. через такой же интервал. При этом расстояние между активными сайтами в практически сферическом димере, однако, по-видимому, не очень хорошо совпадает с расстоянием между сайтами вставки на двух цепях ДНК-мишени, поскольку исследование кристаллических структур, по-видимому, показывает, что активный сайты в димерах разделены более чем на 30 Å при измерении по прямой линии, проходящей через белки, и на еще большее расстояние при измерении по окружности димера. Если предположить, что интерфейс димера сохраняется в функциональном мультимере интегразы, для протекания полной реакции интеграции должен потребоваться как минимум тетрамер интегразы. ^{[ нужна ссылка ]}

3. Карбокси-(С)-концевой домен: С-концевой домен неспецифически связывает ДНК. Поскольку сайты интеграции в ДНК-мишень относительно неспецифичны, считается, что этот домен может каким-то образом работать вместе с ДНК-мишенью. Информация, полученная в результате экспериментов с химерными интегразами, показывает, что узнавание целевого сайта контролируется основным доменом. Исследования перекрестных связей также показывают, что С-концевой домен работает вместе с субтерминальной областью внутри самых концов вирусной ДНК.

В процессе интеграции фермент интеграза ВИЧ выполняет две ключевые каталитические реакции. Сначала происходит 3'-процессинг ДНК ВИЧ, за которым следует перенос цепи ДНК ВИЧ в ДНК хозяина. Интеграция ДНК ВИЧ может происходить либо в делящихся, либо в покоящихся клетках, а фермент интеграза ВИЧ может существовать в форме мономера , димера, тетрамера и, возможно, даже в формах более высокого порядка (таких как октомеры). Каждая частица ВИЧ содержит примерно от 40 до 100 копий фермента интегразы.

Функции интегразы уникальны для ретровирусов; Человеческим клеткам не требуется вырезать и вставлять фрагменты ДНК в геном. По этой причине ингибиторы интегразы являются основной мишенью для разработки лекарственной терапии ВИЧ-инфекции и СПИДа, поскольку ингибирование интегразы не должно препятствовать нормальному функционированию клеток человека.

Механизм интеграции ВИЧ

Интеграция ВИЧ – это вставка генетического материала ВИЧ в геном инфицированной клетки. ^{[ 1 ]} Процесс интеграции ВИЧ включает шесть последовательных шагов:

Связывание ВИЧ-интегразы с ДНК ВИЧ

Первый этап процесса интеграции происходит в цитоплазме клетки-хозяина после завершения обратной транскрипции РНК ВИЧ в к-ДНК. Этот этап включает связывание интегразы – скорее всего, в димерной форме – с каждым концом вновь образованной к-ДНК ВИЧ. Связывание происходит в определенных последовательностях в длинных концевых повторах . Комплекс ДНК-интеграза-ВИЧ является частью внутриклеточной нуклеопротеиновой частицы, известной как « преинтеграционный комплекс » (PIC). Этот комплекс состоит из линейной ДНК ВИЧ, вирусных белков и белков хозяина. Вирусные белки включают интегразу, нуклеокапсид , матрикс, вирусный белок R (Vpr) и обратную транскриптазу . Несколько белков-хозяев также могут образовывать часть этого комплекса, хотя неясно, присоединяются ли некоторые или все к преинтеграционному комплексу до ядерного транспорта. ^{[ нужна ссылка ]}

Процессинг 3'-концов ДНК ВИЧ

На втором этапе процесса интеграции, который также происходит в цитоплазме хозяина , димер интегразы расщепляет вирусную ДНК на каждом 3'-конце. Эта реакция расщепления удаляет динуклеотиды GT на 3'-стороне консервативной динуклеотидной области CA. Расщепление динуклеотида на 3'-конце каждого вирусного ДНК приводит к образованию 5'-конца динуклеотида и реакционноспособного промежуточного продукта, который содержит 3'-гидроксильную группу. Этот этап 3'-процессинга является первой из двух ключевых каталитических реакций, выполняемых ферментом интегразой, и он подготавливает вирусную ДНК к интеграции в ДНК хозяина. В альтернативном взгляде на реакцию связывания ДНК и 3'-процессинга тетрамерная форма интегразы (а не димер) связывается с концами ДНК ВИЧ, а затем расщепляет 3'-концы. ^{[ нужна ссылка ]}

Транслокация интегразы ВИЧ в ядро клетки-хозяина (ядерная транслокация)

На третьем этапе процесса интеграции преинтеграционный комплекс транспортируется в ядро клетки-хозяина, проникая через один из комплексов ядерных пор .

Связывание преинтеграционного комплекса с ДНК хозяина

Внутри ядра белок хозяина, полученный из эпителия хрусталика, фактор роста/p75, обычно называемый сокращенно LEDGF /p75, связывается с преинтеграционным комплексом и ДНК хозяина. LEDGF/p75 служит связующим белком (или мостом) между преинтеграционным комплексом и ДНК хозяина. Последовательность связывания LEDGF/p75 с ДНК хозяина и преинтеграционным комплексом остается неясной. В одной версии LEDGF/p75 сначала связывается с преинтеграционным комплексом, а затем с ДНК хозяина. С другой стороны, LEDGF/p75 может сначала связываться с ДНК хозяина, а затем с преинтеграционным комплексом. Независимо от последовательности считается, что присутствие LEDGF/p75 приводит к сближению димеров интегразы друг с другом с образованием тетрамера. ^{[ нужна ссылка ]}

Перенос ДНК ВИЧ в ДНК хозяина (перенос нитей)

Следующий этап, реакция переноса цепи, происходит внутри ядра клетки-хозяина и включает в себя критический этап вставки ДНК ВИЧ в выбранный участок ДНК хозяина. Область вставки содержит слабоконсервативную палиндромную последовательность. Эта реакция переноса цепи инициируется, когда интеграза ВИЧ катализирует атаку 3'-гидроксильной группы ДНК ВИЧ на ДНК хозяина. Атака ДНК ВИЧ происходит на противоположных цепях ДНК хозяина в шахматном порядке, обычно на расстоянии 4-6 пар оснований. Эта реакция приводит к разрыву связей в парах оснований ДНК хозяина, расположенных между шахматными разрезами, и соединению 3'-гидроксильных групп ВИЧ с 5'-фосфатными концами ДНК хозяина. В этот момент разворачивается недавно присоединенная область ДНК вируса-хозяина. ^{[ нужна ссылка ]}

Ремонт разрывов, образовавшихся в процессе переноса прядей («Gap Repair»)

После процесса переноса цепи соединения ДНК ВИЧ и ДНК хозяина имеют непарные участки ДНК, называемые «пробелами» ДНК. Кроме того, две пары оснований на конце 5'-области вирусной ДНК остаются неспаренными после переноса цепи. В настоящее время считается, что вставка новой ДНК ВИЧ и оставшиеся пробелы по бокам места интеграции вызывают реакцию повреждения клеточной ДНК хозяина, но большая часть этого механизма остается спекулятивной. Реакция на повреждение ДНК хозяина считается решающей на заключительном этапе интеграции, известном как «восстановление пробелов», и может потребовать как минимум трех ферментов хозяина — полимеразы , нуклеазы и лигазы . Считается, что на первом этапе восстановления пробелов фермент(ы) полимеразы расширяют(ют) ДНК хозяина на каждом конце и, таким образом, заполняют пробелы. Далее, возможно, что активность нуклеазы хозяина удаляет 5'-динуклеотидные «лоскуты» на ДНК ВИЧ. Наконец, считается, что ферменты ДНК-лигазы соединяют оставшийся несвязанный сегмент ВИЧ и цепи ДНК хозяина. В настоящее время этот механизм в значительной степени подтвержден экспериментально и находится в стадии исследования. Этот процесс восстановления разрыва завершает интеграцию ДНК ВИЧ в ДНК хозяина, при этом полностью интегрированная ДНК ВИЧ теперь называется «провирусной ДНК». ^{[ нужна ссылка ]}

Роль сплайсинга в ВИЧ-1

Недавнее исследование показало, что ВИЧ-1 предпочитает интегрироваться в гены с высокой степенью сплайсинга или гены с большим количеством интронов. ^{[ 2 ]} Это предпочтение зависит от белка, связывающего хроматин хозяина LEDGF/p75, который взаимодействует со многими факторами сплайсинга. ^{[ 2 ]} Другое исследование показало, что предпочтение ВИЧ-1 генов с высокой степенью сплайсинга зависит от другого фактора хозяина CPSF6, фактора полиаденилирования. ^{[ 3 ]} Раковые гены с большим количеством интронов являются мишенью ВИЧ-1. ^{[ 2 ]}

Ссылки

^ Смит Дж.А., Нуннари Дж., Пройсс М., Померанц Р.Дж., Дэниел Р. (2007). «Пентоксифиллин подавляет трансдукцию векторами на основе ВИЧ-1». Интервирусология . 50 (5): 377–86. дои : 10.1159/000109752 . ПМИД 17938572 . S2CID 34357038 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с Сингх, Пармит Кумар; Пламб Р., Мэтью; Феррис, Андреа Л.; Ибен, Джеймс Р.; У, Сяолинь; Фадель, Хинд Дж.; Люк, Брайан Т.; Эно, Кэролайн; Поешла, Эрик М. (2015). «LEDGF/p75 взаимодействует с факторами сплайсинга мРНК и нацелен на интеграцию ВИЧ-1 в гены с высокой степенью сплайсинга» . Генс Дев . 29 (21): 2287–97. дои : 10.1101/gad.267609.115 . ПМЦ 4647561 . ПМИД 26545813 .
^ Соуд Г.А., Серрао Э., Ван Х., Ван В., Фадель Х.Дж., Поешла Э.М. и др. (2016). «Критическая роль альтернативного фактора полиаденилирования CPSF6 в нацеливании интеграции ВИЧ-1 в транскрипционно активный хроматин» . Proc Natl Acad Sci США . 113 (8): E1054–63. Бибкод : 2016PNAS..113E1054S . дои : 10.1073/pnas.1524213113 . ПМЦ 4776470 . ПМИД 26858452 .

Дальнейшее чтение

Чуффи Анжела; Бушмен Фредерик Д. (2006). «Интеграция ретровирусной ДНК: ВИЧ и роль LEDGF/p75». Тенденции в генетике . 22 (7): 388–395. дои : 10.1016/j.tig.2006.05.006 . ПМИД 16730094 .
Коричневый; и др. (1987). «П.О. Браун, Б. Бауэрман, Х.Е. Вармус, Дж. М. Бишоп, Правильная интеграция ретровирусной ДНК in vitro». Клетка . 49 (3): 347–356. дои : 10.1016/0092-8674(87)90287-х . ПМИД 3032450 . S2CID 35523639 .
Бушмен; и др. (1990). «Интеграция ретровирусной ДНК, управляемая интеграционным белком ВИЧ in vitro» . Наука . 28 (4976): 1555–1558. Бибкод : 1990Sci...249.1555B . дои : 10.1126/science.2171144 . ПМИД 2171144 .
Эллисон; и др. (1990). «В. Х. Эллисон, Х. Абрамс, Т. Роу, Дж. Лифсон, П. О. Браун, Интеграция вируса иммунодефицита человека в бесклеточную систему» . Дж. Вирол . 64 (6): 2711–2715. doi : 10.1128/JVI.64.6.2711-2715.1990 . ПМК 249450 . ПМИД 2335814 .
Энгельман Алан; Мизуути Киёси; Крейги Роберт (1991). «Интеграция ДНК ВИЧ-1: механизм расщепления вирусной ДНК и перенос цепи ДНК». Клетка . 67 (6): 1211–1221. дои : 10.1016/0092-8674(91)90297-C . ПМИД 1760846 . S2CID 1721232 .
Фарнет СМ; Хазелтин, Вашингтон (1990). «Интеграция ДНК вируса иммунодефицита человека типа 1 in vitro» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 87 (11): 4164–4168. Бибкод : 1990PNAS...87.4164F . дои : 10.1073/pnas.87.11.4164 . ПМК 54068 . ПМИД 2349226 .
Лендер ES; Линтон Л.М.; Биррен Б.; Нусбаум К.; Зоди МС; Болдуин Дж.; Девон К.; Дьюар К.; Дойл М.; Фитцхью В.; и др. (2001). «Первичное секвенирование и анализ генома человека» (PDF) . Природа . 409 (6822): 860–921. Бибкод : 2001Natur.409..860L . дои : 10.1038/35057062 . ПМИД 11237011 .

Внешние ссылки

Стоуэлл, Дэн (2006). «прединтеграционный комплекс» . Молекулы ВИЧ - Гиперучебник . Архивировано из оригинала 3 марта 2016 г. Проверено 11 января 2016 г.

[pmid17938572-1] Смит Дж.А., Нуннари Дж., Пройсс М., Померанц Р.Дж., Дэниел Р. (2007). «Пентоксифиллин подавляет трансдукцию векторами на основе ВИЧ-1». Интервирусология . 50 (5): 377–86. дои : 10.1159/000109752 . ПМИД 17938572 . S2CID 34357038 .

[pmid26545813-2] Jump up to: ^а ^б ^с Сингх, Пармит Кумар; Пламб Р., Мэтью; Феррис, Андреа Л.; Ибен, Джеймс Р.; У, Сяолинь; Фадель, Хинд Дж.; Люк, Брайан Т.; Эно, Кэролайн; Поешла, Эрик М. (2015). «LEDGF/p75 взаимодействует с факторами сплайсинга мРНК и нацелен на интеграцию ВИЧ-1 в гены с высокой степенью сплайсинга» . Генс Дев . 29 (21): 2287–97. дои : 10.1101/gad.267609.115 . ПМЦ 4647561 . ПМИД 26545813 .

[pmid26858452-3] Соуд Г.А., Серрао Э., Ван Х., Ван В., Фадель Х.Дж., Поешла Э.М. и др. (2016). «Критическая роль альтернативного фактора полиаденилирования CPSF6 в нацеливании интеграции ВИЧ-1 в транскрипционно активный хроматин» . Proc Natl Acad Sci США . 113 (8): E1054–63. Бибкод : 2016PNAS..113E1054S . дои : 10.1073/pnas.1524213113 . ПМЦ 4776470 . ПМИД 26858452 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]