библиотека кДНК

Библиотека кДНК представляет собой комбинацию клонированных фрагментов кДНК ( комплементарной ДНК ), вставленных в коллекцию клеток-хозяев, которые составляют некоторую часть транскриптома организма и хранятся как « библиотека ». кДНК производится из полностью транскрибируемой мРНК, обнаруженной в ядре , и поэтому содержит только экспрессированные гены организма. Аналогичным образом можно создавать библиотеки тканеспецифических кДНК. В эукариотических клетках зрелая мРНК уже подвергнута сплайсингу , поэтому образующаяся кДНК не имеет интронов и может быть легко экспрессирована в бактериальной клетке. Хотя информация в библиотеках кДНК является мощным и полезным инструментом, поскольку продукты генов легко идентифицировать, в библиотеках отсутствует информация об энхансерах , интронах и других регуляторных элементах, обнаруженных в библиотеке геномной ДНК . ^{[ 1 ]}

Создание библиотеки кДНК

кДНК создается из зрелой мРНК эукариотической клетки с использованием обратной транскриптазы . У эукариот поли-(А) хвост (состоящий из длинной последовательности адениновых нуклеотидов) отличает мРНК от тРНК и рРНК и поэтому может использоваться в качестве праймерного сайта для обратной транскрипции. Проблема заключается в том, что не все транскрипты, например транскрипты гистона , кодируют поли-А-хвост . ^{[ 2 ]}

экстракция мРНК

Во-первых, необходимо выделить шаблон мРНК для создания библиотек кДНК. Поскольку мРНК содержит только экзоны, следует учитывать целостность изолированной мРНК, чтобы кодируемый белок все еще мог быть произведен. Изолированная мРНК должна иметь размер от 500 п.н. до 8 т.п.н. ^{[ 3 ]} Существует несколько методов очистки РНК, таких как экстракция тризола и очистка на колонке . Очистку колонки можно проводить с использованием смол, покрытых олигомерными нуклеотидами dT, и можно использовать такие особенности мРНК, как наличие поли-А-хвоста, когда связываться будут только последовательности мРНК, содержащие указанный признак. желаемую мРНК, связанную с колонкой Затем элюируют .

конструирование кДНК

После очистки мРНК праймер олиго-дТ (короткая последовательность дезокситимидиновых нуклеотидов) связывается с поли-А-хвостом РНК. Праймер необходим для инициации синтеза ДНК с помощью фермента обратной транскриптазы . Это приводит к созданию гибридов РНК-ДНК, в которых одна цепь комплементарной ДНК связана с цепью мРНК. ^{[ 4 ]} Для удаления мРНК используется фермент РНКаза H, который расщепляет основную цепь мРНК и генерирует свободные 3'-ОН-группы, что важно для замены мРНК ДНК. ^{[ 3 ]} ДНК-полимераза I, расщепленная РНК действует как праймер, ДНК-полимераза I может идентифицировать и инициировать замену нуклеотидов РНК на нуклеотиды ДНК. Затем добавляется ^{[ 3 ]} Это обеспечивается самой sscDNA, скручиваясь на 3'-конце, образуя шпильку . Полимераза удлиняет 3'-ОН-конец, а позже петля на 3'-конце открывается под действием разрезающего действия S ₁ нуклеазы . Эндонуклеазы рестрикции и ДНК-лигаза затем используются для клонирования последовательностей в бактериальные плазмиды .

Затем клонированные бактерии отбираются, обычно с помощью селекции антибиотиков. После отбора создаются запасы бактерий, которые позже можно выращивать и секвенировать для составления библиотеки кДНК.

Библиотека кДНК использует

Библиотеки кДНК обычно используются при воспроизведении геномов эукариот, поскольку объем информации сокращается для удаления большого количества некодирующих областей из библиотеки. Библиотеки кДНК используются для экспрессии эукариотических генов у прокариот. Прокариоты не имеют интронов в своей ДНК и, следовательно, не обладают ферментами, которые могли бы вырезать их в процессе транскрипции. кДНК не имеет интронов и поэтому может экспрессироваться в прокариотических клетках. Библиотеки кДНК наиболее полезны в обратной генетике , где дополнительная геномная информация бесполезна. Кроме того, библиотеки кДНК часто используются при функциональном клонировании для идентификации генов на основе функции кодируемого белка. При изучении эукариотической ДНК библиотеки экспрессии создаются с использованием комплементарной ДНК (кДНК), чтобы гарантировать, что вставка действительно является геном. ^{[ 4 ]}

Библиотека кДНК против библиотеки геномной ДНК

В библиотеке кДНК отсутствуют некодирующие и регуляторные элементы, присутствующие в геномной ДНК. Библиотеки геномной ДНК предоставляют более подробную информацию об организме, но их создание и хранение требуют больше ресурсов.

Клонирование кДНК

Молекулы кДНК можно клонировать с использованием линкеров сайтов рестрикции. Линкеры представляют собой короткие двухцепочечные фрагменты ДНК ( олигодезоксирибонуклеотиды ) длиной примерно от 8 до 12 пар нуклеотидов, которые включают сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции, например BamHI. И кДНК, и линкер имеют тупые концы, которые можно лигировать вместе с использованием высокой концентрации ДНК-лигазы Т4. Затем в молекуле кДНК образуются липкие концы путем расщепления концов кДНК (которые теперь имеют линкеры со встроенным сайтом) соответствующей эндонуклеазой. Вектор клонирования ( плазмида ) затем также расщепляется соответствующей эндонуклеазой. После лигирования « липкого конца » вставки в вектор полученную молекулу рекомбинантной ДНК переносят в клетку-хозяина E. coli для клонирования.

См. также

Функциональное клонирование

Ссылки

^ «Библиотеки кДНК — обзор | Темы ScienceDirect» . www.sciencedirect.com . Проверено 19 февраля 2024 г.
^ библиотека кДНК || Как создается библиотека кДНК? || Для чего используются библиотеки ДНК? , получено 19 февраля 2024 г.
^ Jump up to: ^а ^б ^с Ин, Шао-Яо (2004). «Дополнительные библиотеки ДНК: обзор» . Молекулярная биотехнология . 27 (3): 245–252. дои : 10.1385/МБ:27:3:245 . ISSN 1073-6085 . ПМИД 15247497 . S2CID 25600775 .
^ Jump up to: ^а ^б П., Кларк, Дэвид (2009). Биотехнология: применение генетической революции . Паздерник, Нанетт Жан. Амстердам: Академическая пресса/Эльзевир. ISBN 9780121755522 . ОСЛК 226038060 . {{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )

Внешние ссылки

[1] «Библиотеки кДНК — обзор | Темы ScienceDirect» . www.sciencedirect.com . Проверено 19 февраля 2024 г.

[2] библиотека кДНК || Как создается библиотека кДНК? || Для чего используются библиотеки ДНК? , получено 19 февраля 2024 г.

[:0-3] Jump up to: ^а ^б ^с Ин, Шао-Яо (2004). «Дополнительные библиотеки ДНК: обзор» . Молекулярная биотехнология . 27 (3): 245–252. дои : 10.1385/МБ:27:3:245 . ISSN 1073-6085 . ПМИД 15247497 . S2CID 25600775 .

[:1-4] Jump up to: ^а ^б П., Кларк, Дэвид (2009). Биотехнология: применение генетической революции . Паздерник, Нанетт Жан. Амстердам: Академическая пресса/Эльзевир. ISBN 9780121755522 . ОСЛК 226038060 . {{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]