ТИЛЛИНГ (молекулярная биология)

ТИЛЛИНГ ( Нацеливание на индуцированные локальные повреждения геномов ) – это метод молекулярной биологии , который позволяет направленно идентифицировать мутации в определенном гене . TILLING был введен в 2000 году с использованием модельного растения Arabidopsis thaliana и расширен до других применений и методологий небольшой группой ученых, включая Луку Комаи . С тех пор TILLING использовался как метод обратной генетики на других организмах, таких как рыбки данио , кукуруза , пшеница , рис , соевые бобы , томаты и салат .

Обзор

Этот метод сочетает в себе стандартную и эффективную технику мутагенеза с использованием химического мутагена, такого как этилметансульфонат (EMS), с чувствительным методом скрининга ДНК, который идентифицирует одноосновные мутации (также называемые точечными мутациями) в целевом гене. Метод TILLING основан на формировании ДНК гетеродуплексов , которые образуются, когда несколько аллелей амплифицируются с помощью ПЦР , а затем нагреваются и медленно охлаждаются. В месте несоответствия двух нитей ДНК образуется « пузырь », который затем расщепляется одноцепочечной нуклеазой . Затем продукты разделяются по размеру на нескольких разных платформах (см. ниже).

Несовпадения могут быть вызваны индуцированной мутацией, гетерозиготностью внутри особи или естественными вариациями между особями.

ЭкоОБРАБОТКА ^[1]^[2]^[3]^[4] это метод, который использует методы TILLING для поиска естественных мутаций у людей, обычно для анализа популяционной генетики. ДЕКООБРАБОТКА ^[5] представляет собой модификацию TILLING и EcoTILLING, в которой используется недорогой метод идентификации фрагментов. С появлением технологий секвенирования NGS , TILLING-by-Sequencing ^[6] был разработан на основе секвенирования Illumina генов-мишеней, амплифицированных из многомерных объединенных матриц, для выявления возможных однонуклеотидных изменений.

Ферменты одноцепочечного расщепления

Существует несколько источников одноцепочечных нуклеаз. Первым широко используемым ферментом была нуклеаза маша , но было показано, что эта нуклеаза обладает высокой неспецифической активностью и работает только при низком pH, что может разрушать продукты ПЦР и праймеры, меченные красителем. Первоначальным источником одноцепочечной нуклеазы был CEL1 или CJE (экстракт сока сельдерея), но на рынок вышли и другие продукты, включая ферменты SNiPerase компании Frontier Genomics, которые были оптимизированы для использования на платформах, использующих меченые и немеченые продукты ПЦР (см. следующий раздел). Трансгеномная технология выделила одноцепочечный белок нуклеазы и продает его в рекомбинантной форме. Преимущество рекомбинантной формы состоит в том, что в отличие от смесей ферментов она не содержит неспецифической нуклеазной активности, которая может разрушать красители на праймерах ПЦР. Недостаток – существенно более высокая стоимость.

Сепарация расщепленных продуктов

В первой статье, описывающей ТИЛЛИНГ, для идентификации мутаций использовалась ВЭЖХ (McCallum et al., 2000a). Производительность метода стала более высокой за счет использования фермента рестрикции Cel-I в сочетании с системой на основе геля LICOR для выявления мутаций (Colbert et al.,2001). Преимущества использования этой системы заключаются в том, что места мутаций можно легко подтвердить и отличить от шума. Это связано с тем, что для прямого и обратного праймеров можно использовать красители разного цвета. После того как продукты расщепления проанализированы на геле, их можно просмотреть в отдельных каналах, и, как и в случае с ПДРФ, размеры фрагментов внутри дорожки в каждом канале должны в сумме составлять размер полноразмерного продукта. Преимуществами системы LICOR являются разделение больших фрагментов (~ 2 КБ), высокая пропускная способность образцов (96 образцов загружаются в бумажные гребенки) и бесплатное программное обеспечение для идентификации мутаций (GelBuddy). Недостатками системы LICOR являются необходимость заливки пластинчатых гелей и длительное время работы (~ 4 часа). Методы TILLING и EcoTILLING в настоящее время используются в капиллярных системах от Advanced Analytical Technologies, ABI и Beckman.

Для разделения продуктов ПЦР, не помеченных красителями, можно использовать несколько систем. Простые системы агарозного электрофореза позволяют недорого и с использованием стандартного лабораторного оборудования разделить продукты расщепления. Этот метод был использован для обнаружения SNP в кете и получил название DEcoTILLING. Недостатком этой системы является пониженное разрешение по сравнению с полиакриламидными системами. Компания Elchrom Scientific продает готовые гели Spreadex, которые отличаются высокой производительностью и более чувствительны, чем стандартные полиакриламидные гели. Advanced Analytical Technologies Inc продает флуоресцентную систему dsDNA AdvanCE FS96, которая представляет собой систему капиллярного электрофореза 96, имеющую ряд преимуществ по сравнению с традиционными методами; включая способность разделять большие фрагменты (до 40 КБ), отсутствие необходимости в стадии обессоливания или осаждения, короткое время анализа (~ 30 минут), чувствительность до 5 пг/мл и отсутствие необходимости в праймерах, меченных флуоресцентной меткой.

ПХОДНЫЕ центры

В мире существует несколько центров TILLING, которые специализируются на сельскохозяйственно важных видах:

Райс – Калифорнийский университет в Дэвисе (США)
Кукуруза – Университет Пердью (США)
Brassica napus – Университет Британской Колумбии (Калифорния)
Brassica rapa – Центр Джона Иннеса (Великобритания)
Арабидопсис - Исследование рака Фреда Хатчинсона
Соевые бобы – Университет Южного Иллинойса (США)
Лотос и Медикаго – Центр Джона Иннеса (Великобритания)]
Пшеница – Калифорнийский университет в Дэвисе (США)
Горох, помидоры - INRA (Франция)
Помидор – RTGR, Хайдарабадский университет (Индия)

Ссылки

^ Комай, Л. ; Янг, К.; Тилль, Би Джей; Рейнольдс, Ш.; Грин, Э.А.; Кодомо, Калифорния; Эннс, LC; Джонсон, Дж. Э.; Бертнер, К.; Одден, Арканзас; Хеникофф, С. (2004). «Эффективное обнаружение полиморфизмов ДНК в природных популяциях с помощью экотиллинга». Заводской журнал . 37 (5): 778–786. дои : 10.1111/j.0960-7412.2003.01999.x . ПМИД 14871304 .
^ Гилкрист, Э.Дж.; Хон, GW; Ин, CC; Отто, СП; Чжуан, Дж.; Чунг, Д.; Хамбергер, Б.; Абутораби, Ф.; Калыняк Т.; Джонсон, ЛИ; Больманн, Дж.; Эллис, Б.Э.; Дуглас, CJ; Кронк, QCB (2006). «Использование экотиллинга как эффективного инструмента обнаружения SNP для изучения генетических вариаций в диких популяциях Populus trichocarpa». Молекулярная экология . 15 (5): 1367–1378. Бибкод : 2006MolEc..15.1367G . дои : 10.1111/j.1365-294X.2006.02885.x . ПМИД 16626459 . S2CID 16198260 .
^ Меджледе, Н.; Кийовска, З.; Бэкес, Г.; Бурхенн, К.; Расмуссен, СК; Джахур, А. (2006). «EcoTILLING для идентификации аллельных вариаций генов устойчивости к мучнистой росе mlo и Mla ячменя» (PDF) . Селекция растений . 125 (5): 461–467. дои : 10.1111/j.1439-0523.2006.01226.x . S2CID 62901355 .
^ Ньето, Дж.; Пайрон, Ф.; Далмайс, М.; Марко, CF; Морионес, Э.; Гомес-Гильямон, ML; Трунигер, В.; Гомес, П.; Гарсиа-Мас, Дж.; Аранда, Массачусетс; Бендахман, А. (2007). «EcoTILLING для идентификации аллельных вариантов eIF4E дыни, фактора, контролирующего восприимчивость к вирусам» . Биология растений BMC . 7:34 . дои : 10.1186/1471-2229-7-34 . ПМК 1914064 . ПМИД 17584936 .
^ Гарвин, MR; Гарретт, Эй Джей (2007). «DEco-TILLING: недорогой метод обнаружения полиморфизма одиночных нуклеотидов, который уменьшает систематическую ошибку в оценке». Заметки по молекулярной экологии . 7 (5): 735–746. дои : 10.1111/j.1471-8286.2007.01767.x .
^ Цай, Хелен; Хауэлл, Тайсон; Нитчер, Ребекка; Миссириан, Виктор; Уотсон, Брайан; Нго, Кэти Дж.; Либерман, Мерич; Фасс, Джозеф; Уауи, Кристобаль; Тран, Роберт К.; Хан, Асиф Али; Фильков Владимир; Тай, Томас Х.; Дубковский, Хорхе; Комай, Лука (2011). «Обнаружение редких мутаций в популяциях: TILLING путем секвенирования» . Физиология растений . 156 (3): 1257–1268. дои : 10.1104/стр.110.169748 . ПМК 3135940 . ПМИД 21531898 .

Научная литература

Кольбер, Т; Тилль, Би Джей; Томпа, Р; Рейнольдс, С; Стайн, Миннесота; Юнг, АТ; МакКаллум, CM; Комай, Л ; Хеникофф, С. (июнь 2001 г.). «Высокопроизводительный скрининг индуцированных точковых мутаций» . Физиол растений . 126 (2): 480–4. дои : 10.1104/стр.126.2.480 . ПМК 1540114 . ПМИД 11402178 .
Дрейпер, BW; МакКаллум, CM; Стаут, Дж.Л.; Слэйд, Эй Джей; Моенс, CB (2004). «Высокопроизводительный метод выявления точечных мутаций, индуцированных N-этил-N-нитрозомочевиной (ENU), у рыбок данио». Рыбка данио: генетика, геномика и информатика . Методы клеточной биологии. Том. 77. С. 91–112. дои : 10.1016/s0091-679x(04)77005-3 . ISBN 9780125641722 . ПМИД 15602907 . {{cite book}}: |journal= игнорируется ( помогите )
МакКаллум, CM; Комай, Л ; Грин, Э.А.; Хеникофф, С. (апрель 2000 г.). «Целевой скрининг индуцированных мутаций». Нат Биотехнология . 18 (4): 455–7. дои : 10.1038/74542 . ПМИД 10748531 . S2CID 12063367 .
МакКаллум, CM; Комай, Л ; Грин, Э.А.; Хеникофф, С. (июнь 2000 г.). «Нацеливание на индуцированные локальные повреждения В геномах (TILLING) для функциональной геномики растений» . Физиол растений . 123 (2): 439–42. дои : 10.1104/стр.123.2.439 . ПМЦ 1539256 . ПМИД 10859174 .
Слэйд, Эй Джей; Фюрстенберг, СИ; Леффлер, Д; Стайн, Миннесота; Фаччиотти, Д. (январь 2005 г.). «Обратный генетический, нетрансгенный подход к улучшению урожая пшеницы с помощью TILLING». Нат Биотехнология . 23 (1): 75–81. дои : 10.1038/nbt1043 . ПМИД 15580263 . S2CID 12109468 .

Внешние ссылки

[1] Комай, Л. ; Янг, К.; Тилль, Би Джей; Рейнольдс, Ш.; Грин, Э.А.; Кодомо, Калифорния; Эннс, LC; Джонсон, Дж. Э.; Бертнер, К.; Одден, Арканзас; Хеникофф, С. (2004). «Эффективное обнаружение полиморфизмов ДНК в природных популяциях с помощью экотиллинга». Заводской журнал . 37 (5): 778–786. дои : 10.1111/j.0960-7412.2003.01999.x . ПМИД 14871304 .

[2] Гилкрист, Э.Дж.; Хон, GW; Ин, CC; Отто, СП; Чжуан, Дж.; Чунг, Д.; Хамбергер, Б.; Абутораби, Ф.; Калыняк Т.; Джонсон, ЛИ; Больманн, Дж.; Эллис, Б.Э.; Дуглас, CJ; Кронк, QCB (2006). «Использование экотиллинга как эффективного инструмента обнаружения SNP для изучения генетических вариаций в диких популяциях Populus trichocarpa». Молекулярная экология . 15 (5): 1367–1378. Бибкод : 2006MolEc..15.1367G . дои : 10.1111/j.1365-294X.2006.02885.x . ПМИД 16626459 . S2CID 16198260 .

[3] Меджледе, Н.; Кийовска, З.; Бэкес, Г.; Бурхенн, К.; Расмуссен, СК; Джахур, А. (2006). «EcoTILLING для идентификации аллельных вариаций генов устойчивости к мучнистой росе mlo и Mla ячменя» (PDF) . Селекция растений . 125 (5): 461–467. дои : 10.1111/j.1439-0523.2006.01226.x . S2CID 62901355 .

[4] Ньето, Дж.; Пайрон, Ф.; Далмайс, М.; Марко, CF; Морионес, Э.; Гомес-Гильямон, ML; Трунигер, В.; Гомес, П.; Гарсиа-Мас, Дж.; Аранда, Массачусетс; Бендахман, А. (2007). «EcoTILLING для идентификации аллельных вариантов eIF4E дыни, фактора, контролирующего восприимчивость к вирусам» . Биология растений BMC . 7:34 . дои : 10.1186/1471-2229-7-34 . ПМК 1914064 . ПМИД 17584936 .

[5] Гарвин, MR; Гарретт, Эй Джей (2007). «DEco-TILLING: недорогой метод обнаружения полиморфизма одиночных нуклеотидов, который уменьшает систематическую ошибку в оценке». Заметки по молекулярной экологии . 7 (5): 735–746. дои : 10.1111/j.1471-8286.2007.01767.x .

[6] Цай, Хелен; Хауэлл, Тайсон; Нитчер, Ребекка; Миссириан, Виктор; Уотсон, Брайан; Нго, Кэти Дж.; Либерман, Мерич; Фасс, Джозеф; Уауи, Кристобаль; Тран, Роберт К.; Хан, Асиф Али; Фильков Владимир; Тай, Томас Х.; Дубковский, Хорхе; Комай, Лука (2011). «Обнаружение редких мутаций в популяциях: TILLING путем секвенирования» . Физиология растений . 156 (3): 1257–1268. дои : 10.1104/стр.110.169748 . ПМК 3135940 . ПМИД 21531898 .

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]