Кассетный мутагенез
Кассетный мутагенез — это тип сайт-направленного мутагенеза , при котором используется короткая двухцепочечная олигонуклеотидная последовательность ( генная кассета ) для замены фрагмента целевой ДНК . Для достижения специфичности он использует комплементарные расщепляемые ферментом рестрикции концы целевой ДНК и генной кассеты . Он отличается от методов, в которых используется одиночный олигонуклеотид , тем, что одна кассета гена может содержать несколько мутаций. В отличие от многих методов сайт-направленного мутагенеза, кассетный мутагенез также не включает удлинение праймера с помощью ДНК-полимеразы . [1] [2] [3] [4] [5]
Механизм
[ редактировать ]Во-первых, ферменты рестрикции используются для расщепления ДНК вблизи целевой последовательности, содержащейся в подходящем векторе . На этом этапе удаляется целевая последовательность и все, что находится между сайтами рестрикции. Затем синтетическую двухцепочечную ДНК, содержащую желаемую мутацию и концы , комплементарные концам рестрикционного расщепления, вместо лигируют удаленной последовательности. Наконец, полученную конструкцию секвенируют , чтобы проверить, содержит ли целевая последовательность намеченную мутацию. [1]
Использование
[ редактировать ]Использование синтетической генной кассеты позволяет полностью контролировать тип мутации, которая может возникнуть. При изучении функций белков кассетный мутагенез может позволить ученым изменять отдельные аминокислоты , вводя разные кодоны или опуская кодоны. [1] [2]
Включив последовательность SD и несколько первых кодонов гена, ученый может легко и существенно повлиять на уровень экспрессии белка, изменяя эти регуляторные последовательности . [2]
Ограничения
[ редактировать ]Чтобы использовать этот метод, необходимо знать последовательность целевой последовательности и близлежащие сайты рестрикции. Поскольку ферменты рестрикции используются , чтобы этот метод был полезен, сайты рестрикции, фланкирующие целевую ДНК, должны быть уникальными в системе ген / вектор , чтобы генную кассету можно было вставить со специфичностью. Длина последовательности, фланкированной сайтами рестрикции, также является ограничивающим фактором из-за использования синтетических генных кассет. [2] [3]
Преимущества
[ редактировать ]Поскольку одна генная кассета может содержать несколько мутаций, требуется меньше общего синтеза и очистки олигонуклеотидов. По сравнению с методами мутагенеза, требующими синтеза двухцепочечной ДНК с использованием одноцепочечной матрицы (1-30% in vitro в М13 ), эффективность лигирования олигодезоксинуклеотидной кассеты близка к 100%. Высокая эффективность мутагенеза означает, что мутанты могут быть проверены непосредственно путем секвенирования. [2] После того как вектор снабжен фланкирующими сайтами рестрикции, все манипуляции (т.е. мутагенез , секвенирование , экспрессия ) могут быть выполнены в одной и той же плазмиде . [2]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с Уорролл, Эндрю (1994). «Сайт-направленный мутагенез кассетным методом». Методы молекулярной биологии . Том. 30. Хумана Пресс. стр. 199–210. дои : 10.1385/0-89603-256-6:199 . ISBN 978-1-59259-517-4 . ПМИД 8004195 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж Уэллс, Дж.А.; Вассер, М; Пауэрс, Д.Б. (1985). «Кассетный мутагенез: эффективный метод создания множественных мутаций в определенных сайтах». Джин . 34 (2–3): 315–23. дои : 10.1016/0378-1119(85)90140-4 . ПМИД 3891521 .
- ^ Jump up to: а б Клор, Адам; Рейнертсон, Брайан; Роуз, Скотт; Сабель, Джейме. «Руководство по применению мутагенеза ультрамерных олигонуклеотидов - обзор эксперимента, протокол, устранение неполадок» (PDF) . WWW.IDTDNA.COM . Интегрированные ДНК-технологии. п. 16. Архивировано из оригинала (PDF) 5 декабря 2014 года . Проверено 6 ноября 2014 г.
- ^ Кеглер-Эбо, DM; Доктор, CM; Димайо, Д. (1994). «Мутагенез кодонных кассет: общий метод вставки или замены отдельных кодонов с использованием универсальных мутагенных кассет» . Исследования нуклеиновых кислот . 22 (9): 1593–9. дои : 10.1093/нар/22.9.1593 . ПМК 308034 . ПМИД 8202358 .
- ^ Эль-Манси, ЕМТ; Брайс, CFA; Демейн, Арнольд Л.; А. Р. Оллман (25 октября 2006 г.). Микробиология и биотехнология ферментации, второе издание . ЦРК Пресс. стр. 222–. ISBN 978-0-8493-5334-5 . Проверено 27 ноября 2014 г.