Иммунопероксидаза
Иммунопероксидаза — это тип иммуноокрашивания, используемый в молекулярной биологии , медицинских исследованиях и клинической диагностике. В частности, реакции иммунопероксидазы относятся к подклассу иммуногистохимических или иммуноцитохимических процедур, в которых антитела визуализируются посредством реакции, катализируемой пероксидазой.
Иммуногистохимия и иммуноцитохимия — методы, используемые для определения, в каких клетках или частях клеток тот или иной белок или другая макромолекула находится . Эти пятна используют антитела для связывания со специфическими антигенами , обычно белкового или гликопротеинового происхождения. Поскольку антитела обычно невидимы, для обнаружения этих связанных антител необходимо использовать специальные стратегии. В процедуре иммунопероксидазы фермент , известный как пероксидаза, используется для катализа химической реакции с образованием окрашенного продукта.
Проще говоря, очень тонкий срез ткани фиксируется на стекле и инкубируется с антителом или рядом антител, последнее из которых химически связано с пероксидазой. После проявления пятна путем добавления химического субстрата распределение пятна можно изучить с помощью микроскопии .
Типы антител
[ редактировать ]Первоначально все антитела, полученные для иммуноокрашивания, были поликлональными , т.е. вырабатывались в результате нормальной реакции антител у животных, таких как лошади или кролики. Сейчас многие из них являются моноклональными , т.е. производятся в тканевой культуре. Моноклональные антитела, состоящие только из одного типа антител, как правило, обеспечивают большую антигенную специфичность, а также имеют тенденцию быть более согласованными между партиями.
Методы окраски иммунопероксидазой
[ редактировать ]Первым этапом окрашивания иммунопероксидазой является связывание специфического (первичного) антитела с образцом клетки или ткани. Затем обнаружение первичного антитела может быть осуществлено напрямую (пример 1) или косвенно (примеры 2 и 3).
- Пример 1. Первичное антитело можно напрямую пометить ферментом пероксидазой , который затем используется для катализа химической реакции с образованием окрашенного продукта.
- Пример 2. Первичное антитело можно пометить небольшой молекулой, которая может распознаваться конъюгированной с пероксидазой связывающей молекулой с высоким сродством. Наиболее распространенным примером этого является связанное с биотином первичное антитело, которое связывается со связанным с ферментом стрептавидином . Этот метод можно использовать для усиления сигнала.
- Пример 3. Немеченое первичное антитело выявляют с использованием обычного вторичного антитела , которое распознает все антитела, происходящие от того же вида животных, что и первичное. Вторичное антитело помечено пероксидазой.
Оптимальное окрашивание зависит от ряда факторов, включая разведение антител, красящие химикаты, подготовку и/или фиксацию клеток/тканей, а также продолжительность инкубации с антителами/окрашивающими реагентами. Они часто определяются методом проб и ошибок, а не каким-либо систематическим подходом.
Альтернативы окрашиванию пероксидазой
[ редактировать ]другие каталитические ферменты, такие как щелочная фосфатаза, Вместо пероксидаз можно использовать как для прямого, так и для непрямого окрашивания. Альтернативно, первичное антитело можно обнаружить с помощью флуоресцентной метки ( иммунофлуоресценция ) или прикрепить к частицам коллоидного золота для электронной микроскопии .
Использование окрашивания иммунопероксидазой
[ редактировать ]Окраску иммунопероксидазой применяют в клинической диагностике и в лабораторных исследованиях .
В клинической диагностике иммуноокрашивание биоптатов тканей можно использовать для более детального гистопатологического исследования. В случае рака это может помочь в подклассификации опухолей. Иммуноокрашивание также можно использовать для диагностики кожных заболеваний, гломерулонефрита и классификации амилоидных отложений. Сопутствующие методы также полезны для субтипирования лимфоцитов , которые при световой микроскопии выглядят очень похоже.
В лабораторных исследованиях антитела против специфических маркеров клеточной дифференцировки можно использовать для маркировки отдельных типов клеток. Это может позволить лучше понять механические изменения в конкретных клеточных линиях в результате конкретного экспериментального вмешательства.