Подвесная культура
Клеточная суспензия или суспензионная культура представляет собой тип клеточной культуры , в которой отдельные клетки или небольшие агрегаты клеток могут функционировать и размножаться в перемешиваемой питательной среде , образуя таким образом суспензию . Суспензионная культура — это один из двух классических типов клеточной культуры, второй — адгезивная культура . История суспензионной клеточной культуры тесно связана с историей клеточной культуры в целом, но отличается методами поддержания и коммерческого применения. Сами клетки могут быть получены либо из гомогенизированной ткани , либо из растворов гетерогенных клеток. Суспензионную культуру клеток обычно используют для культивирования неадгезивных клеточных линий, таких как гемопоэтические клетки, растительные клетки и клетки насекомых . [1] Хотя некоторые клеточные линии культивируются в суспензии, большинство коммерчески доступных клеточных линий млекопитающих являются адгезивными. [2] [3] Суспензионные клеточные культуры необходимо перемешивать для поддержания клеток в суспензии, и для этого может потребоваться специальное оборудование (например, магнитная мешалка, орбитальные шейкеры, инкубаторы) и колбы (например, культуральные колбы, вращающиеся колбы, шейкеры). [4] Эти культуры необходимо поддерживать на средах, содержащих питательные вещества, и культивировать в определенном диапазоне плотности клеток, чтобы избежать гибели клеток. [5]
История
[ редактировать ]
История суспензионной клеточной культуры тесно связана с общей историей культуры клеток и тканей. В 1885 году Вильгельм Ру заложил основу для будущей культуры тканей, разработав солевой буфер, который использовался для поддержания живых клеток (куриных эмбрионов) в течение нескольких дней. [6] Росс Грэнвилл Харрисон в 1907 году затем разработал методы культивирования клеток in vitro , включая модификацию метода висячей капли для нервных клеток и введение асептической техники в процесс культивирования. [7] Позже, в 1910 году, Монтроуз Томас Берроуз адаптировал технику Харрисона и в сотрудничестве с Алексисом Каррелом создал несколько культур тканей, которые можно было поддерживать in vitro, используя свежую плазму в сочетании с физиологическими растворами. [8] Каррел продолжил разработку первой известной линии клеток, линии, полученной из сердца куриного эмбриона, которую непрерывно поддерживали в течение 34 лет. [9] Хотя «бессмертие» клеточной линии позже было оспорено Леонардом Хейфликом , это стало крупным прорывом и вдохновило других на создание других клеточных линий. [10] Примечательно, что в 1952 году Джордж Отто Гей и его помощница Мэри Кубичек культивировали первую линию иммортализованных клеток человеческого происхождения — HeLa . В то время как другие клеточные линии были прикреплены, клетки HeLa можно было поддерживать в суспензии. [11]
Методы и обслуживание
[ редактировать ]Выделение клеток и запуск культуры
[ редактировать ]Все первичные клетки (клетки, полученные непосредственно от субъекта) необходимо сначала извлечь из субъекта, изолировать (с использованием ферментов пищеварения) и суспендировать в среде перед культивированием. [1] Однако это не означает, что эти клетки совместимы с суспензионной культурой, поскольку большинство клеток млекопитающих являются адгезивными и для деления должны прикрепляться к поверхности. Лейкоциты можно взять у субъекта и культивировать в суспензии, поскольку они естественным образом существуют в крови в суспензии. [12] Адгезия лейкоцитов in vivo обычно является результатом воспалительного иммунного ответа и требует специфических межклеточных взаимодействий, которые не должны происходить в суспензии лейкоцитов одного типа. [13]
Иммортализованные клеточные линии млекопитающих (клетки, способные к неограниченной репликации), растительные клетки и клетки насекомых можно получить в криоконсервированном виде у производителей и использовать для создания суспензионной культуры. [14] Чтобы начать культивирование криоконсервированных клеток, клетки необходимо сначала разморозить и добавить в колбу или биореактор, содержащий среду. В зависимости от криопротекторного агента, возможно, потребуется промыть клетки, чтобы избежать вредного воздействия агента. [3]
Поддержание суспензионных клеточных культур для лабораторий
[ редактировать ]Суспензионные клеточные культуры во многом схожи с прикрепившимися культурами. Оба требуют специализированных питательных сред, содержащих питательные вещества, контейнеров, которые позволяют транспортировать газ, асептических условий, чтобы избежать загрязнения, и частого пассажа, чтобы предотвратить перенаселенность клеток. Однако даже несмотря на эти сходства между этими методами культивирования есть несколько ключевых различий. Например, хотя как прикрепившиеся, так и суспензионные клеточные культуры можно хранить в стандартных колбах, таких как колба для тканевых культур Т-75, суспензионные культуры необходимо перемешивать, чтобы избежать осаждения на дно колбы. В то время как прикрепившиеся клеточные культуры можно хранить в плоских колбах с большой площадью поверхности (чтобы способствовать адгезии клеток), суспензионные культуры требуют перемешивания, в противном случае клетки упадут на дно колбы, что значительно ухудшит их доступ к питательным веществам и кислороду, что в конечном итоге приведет к при гибели клеток. [4] По этой причине были разработаны специализированные колбы (в том числе вращающаяся колба и шейкер, обсуждаемые ниже) для перемешивания среды и поддержания клеток в суспензии. Однако перемешивание среды подвергает клетки воздействию сил сдвига , которые могут вызвать стресс у клеток и отрицательно повлиять на рост. Хотя как прикрепившиеся, так и суспензионные клеточные культуры требуют среды, среды, используемые в суспензионной культуре, могут содержать поверхностно-активное вещество для защиты клеток от сил сдвига в дополнение к аминокислотам, витаминам и солевому раствору, содержащемуся в культуральной среде, такой как DMEM . [5]
Спиннерные колбы
[ редактировать ]Спиннерные колбы, которые используются для суспензионных культур, содержат магнитную вращающуюся штангу, которая обеспечивает циркуляцию среды по колбе и удерживает клетки в суспензии. [15] Спиннерные колбы содержат одно центральное отверстие с крышкой, окруженное двумя выступающими выступами, которые также закрыты крышкой и обеспечивают дополнительный газообмен. Сама магнитная вращающаяся штанга обычно подвешивается на стержне, прикрепленном к центральной крышке, чтобы максимизировать циркуляцию среды в клеточной суспензии. При культивировании клеток вращающуюся колбу, содержащую клетки, помещают на магнитную мешалку внутри инкубатора, и параметры вращающейся машины необходимо тщательно регулировать, чтобы избежать уничтожения клеток сдвигающими силами. [16]
Шейкерные колбы
[ редактировать ]Колбы-шейкеры также используются для суспензионных культур и внешне похожи на типичные колбы Эрленмейера, но имеют полупроницаемую крышку, обеспечивающую газообмен. [17] Во время суспензионного культивирования клеток в шейкерные колбы загружают клетки и соответствующую среду перед их помещением на орбитальный шейкер. Чтобы оптимизировать пролиферацию клеточной культуры, частота вращения орбитального шейкера в минуту должна быть отрегулирована в пределах приемлемого диапазона в зависимости от используемых клеток и среды. Среде необходимо дать возможность перемешиваться, но она не должна слишком сильно беспокоить клетки, вызывая у них чрезмерный стресс. Колбы-шейкеры часто используются для ферментации культур с такими микроорганизмами, как дрожжи. [18]
Пассирование (субкультивирование) клеток
[ редактировать ]Пассирование или субкультивирование суспензионных клеточных культур является более простым, чем пассирование прикрепившихся клеток. В то время как прикрепившиеся клетки требуют первоначальной обработки ферментом пищеварения, чтобы удалить их с поверхности культурального флакона, суспензионные клетки свободно плавают в среде. [19] Затем можно взять образец культуры и проанализировать его для определения соотношения живых и мертвых клеток (с использованием красителя, такого как трипановый синий ) и общей концентрации клеток в колбе (с помощью гемоцитометра ). Используя эту информацию, часть текущей суспензионной культуры будет перенесена в свежую колбу и дополнена средой. Число пассажей должно быть записано, особенно если клетки являются первичными и не иммортализованы, поскольку первичные клеточные линии в конечном итоге подвергаются старению . [20] Суспензионные клетки часто пассируют сразу, без замены среды. Чтобы заменить среду для суспензионной культуры, все клетки из текущего контейнера следует удалить и центрифугировать в осадок. Затем излишки среды удаляют из центрифугированного образца, и колбу снова наполняют свежей средой перед повторным добавлением клеток в колбу. Смена среды и субкультивирование важны для поддержания клеточных линий, поскольку для размножения клетки будут потреблять питательные вещества в среде. Клетки также будут расти в геометрической прогрессии, пока окружающая среда не станет негостеприимной из-за нехватки питательных веществ, слишком высокого уровня pH или нехватки места для роста.
Коммерческое применение суспензионной клеточной культуры
[ редактировать ]В отличие от прикрепившихся культур , которые ограничены площадью поверхности, предназначенной для их распространения, суспензионные культуры ограничены объемом контейнера. Это означает, что суспензионные клетки могут существовать в гораздо больших количествах в данной колбе и являются предпочтительными при использовании клеток для производства продуктов, включая белки, антитела, метаболиты, или просто для производства большого объема клеток. Однако существует гораздо меньше линий суспензионных клеток млекопитающих, чем линий адгезивных клеток млекопитающих. В большинстве крупномасштабных суспензионных культур используются клетки, не относящиеся к млекопитающим, и их выращивание происходит в биореакторах.
Некоторые примеры суспензионной клеточной культуры:
- Продукция антител гибридомами [21]
- Культуры брожения для пива [22]
- Производство терапевтического белка клетками CHO [23]
- Производство вторичных метаболитов лекарств в растительных клетках [24]
- Производство рекомбинантного белка в клетках насекомых [25]
- Массовое производство белка для исследований ферментов и вакцин [26]
- Получение клеточных суспензионных культур для поддержки онколитического аденовируса, используемого в иммунотерапии рака. [27]
Список линий суспензионных клеток
[ редактировать ]| Клеточная линия | Значение | Организм | Ткань происхождения | Морфология | Ссылки |
|---|---|---|---|---|---|
| ДАВАТЬ | Яичник китайского хомячка | Хомяк | яичник | Эпителиальный | ECACC Целлозавр |
| Весь | «Генриетта Лакс» | Человек | Эпителий шейки матки | Рак шейки матки | ECACC Целлозавр |
| Н-9 | Человек | Эмбриональные стволовые клетки | лимфобласт | Целлозавр | |
| Юркат | Человек | Белые кровяные тельца | лимфобласт | ECACC Целлозавр | |
| С6/36 | Насекомое — азиатский тигровый комар | Личиночная ткань | ECACC Целлозавр | ||
| Дай пять | Насекомое (моль) — Trichoplusia ni | яичник | Целлозавр | ||
| С2 | Шнайдер 2 | Насекомое - Drosophila melanogaster | Эмбрионы поздней стадии (20–24 часа) | ATCC Целлозавр | |
| Sf21 | Spodoptera frugiperda 21 | Насекомое (моль) — Spodoptera frugiperda | яичник | ECACC Целлозавр | |
| Сф9 | Spodoptera frugiperda 9 | Насекомое (моль) — Spodoptera frugiperda | яичник | Эпителиальный | ECACC Целлозавр |
| SH-SY5Y | Человек | Костный мозг | Эпителиальный | Целлозавр | |
| ПК-3 | Человек | Простата | Эпителиальный | Целлозавр |
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Перейти обратно: а б Справочник по основам клеточной культуры Gibco . www.invitrogen.com/cellculturalbasics: Thermofisher Scientific.
- ^ «Основы клеточной культуры: оборудование, основы и протоколы» . Клеточная наука от технологических сетей . Проверено 8 ноября 2021 г.
- ^ Перейти обратно: а б Сигма Олдрич. «Фундаментальные методы культивирования клеток. Лабораторное руководство, 3-е издание» (PDF) . Проверено 7 ноября 2021 г.
- ^ Перейти обратно: а б Тая, М.; Кино-ока, М. (01.01.2011), Му-Янг, Мюррей (редактор), «2.27 - Биореакторы для культур клеток животных» , Комплексная биотехнология (второе издание) , Берлингтон: Academic Press, стр. 373– 382, ISBN 978-0-08-088504-9 , получено 30 октября 2021 г.
- ^ Перейти обратно: а б «Субкультивирование суспензионных клеток - США» . www.thermofisher.com . Проверено 30 октября 2021 г.
- ^ Хоффман, Р.М. (26 сентября 2016 г.). «Начало тканевой культуры» . Elsevier SciTech Connect . Проверено 29 ноября 2022 г.
- ^ «Росс Грэнвилл Харрисон (1870-1959) | Энциклопедия проекта «Эмбрион»» . «эмбрион.asu.edu ». Проверено 29 ноября 2022 г.
- ^ «Методы культивирования тканей Алексиса Каррела | Энциклопедия проекта эмбрионов» . «эмбрион.asu.edu ». Проверено 29 ноября 2022 г.
- ^ Енджейчак-Силичка, Магдалена (10 мая 2017 г.). История клеточной культуры . ИнтехОпен. ISBN 978-953-51-3134-2 .
- ^ Цзян, Лицзин. « Методы культивирования тканей Алексиса Каррела». Энциклопедия проекта «Эмбрион»» . «эмбрион.asu.edu ». Проверено 18 октября 2021 г.
- ^ Склот, Ребекка (2010). Бессмертная жизнь Генриетты Лакс . Нью-Йорк: Издательство Crown. ISBN 978-1-4000-5217-2 . OCLC 326529053 .
- ^ Грейнджер, Д. Нил; Сенченкова, Елена (2010). Адгезия лейкоцитов и эндотелиальных клеток . Морган и Клейпул Науки о жизни.
- ^ Альбертс, Брюс; Джонсон, Александр; Льюис, Джулиан; Рафф, Мартин; Робертс, Кейт; Уолтер, Питер (2002). «Клеточно-клеточная адгезия» . Молекулярная биология клетки. 4-е издание .
- ^ «Криоконсервация клеток млекопитающих – США» . www.thermofisher.com . Проверено 2 декабря 2022 г.
- ^ Фрид, Лиза Э.; Гилак, Фаршид (1 января 2007 г.), Ланца, Роберт; Лангер, Роберт; Ваканти, Джозеф (ред.), «Глава одиннадцатая — Разработка функциональных тканей» , Принципы тканевой инженерии (третье издание) , Берлингтон: Academic Press, стр. 137–153, ISBN 978-0-12-370615-7 , получено 30 октября 2021 г.
- ^ Куртис Каспер, Милинд Сингх, Ф.; Микос, Антониос Г. (01 января 2013 г.), Ратнер, Бадди Д.; Хоффман, Аллан С.; Шен, Фредерик Дж.; Лемонс, Джек Э. (ред.), «Глава II.6.3 - Каркасы тканевой инженерии» , Biomaterials Science (третье издание) , Academic Press, стр. 1138–1159, ISBN 978-0-12-374626-9 , получено 30 октября 2021 г.
{{citation}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Клёкнер, В.; Бюкс, Дж. (01 января 2011 г.), Му-Янг, Мюррей (редактор), «2.17 - Биореакторы со встряхиваемыми колбами» , Комплексная биотехнология (второе издание) , Берлингтон: Academic Press, стр. 213–226, ISBN 978-0-08-088504-9 , получено 30 октября 2021 г.
- ^ Линк, Х.; Вестер-Ботц, Д. (01.01.2011), Му-Янг, Мюррей (редактор), «2.11 - Составление и разработка среды» , Комплексная биотехнология (второе издание) , Берлингтон: Academic Press, стр. 119–134. , ISBN 978-0-08-088504-9 , получено 30 октября 2021 г.
- ^ Справочник по основам клеточной культуры Gibco . www.invitrogen.com/cellculturalbasics: Thermofisher Scientific.
- ^ Сигма Олдрич. «Фундаментальные методы культивирования клеток. Лабораторное руководство, 3-е издание» (PDF) . Проверено 7 ноября 2021 г.
- ^ Ли, Фэн; Виджаясанкаран, Натараджан; Шен, Эми (Ицзюань); Поцелуй, Роберт; Аманулла, Ашраф (2010). «Процессы культивирования клеток для производства моноклональных антител» . МАБ . 2 (5): 466–477. дои : 10.4161/mabs.2.5.12720 . ISSN 1942-0862 . ПМЦ 2958569 . ПМИД 20622510 .
- ^ Пилкингтон, штат Пенсильвания; Маргаритис, А.; Менсур, Северная Каролина; Рассел, И. (1998). «Основы иммобилизованных дрожжевых клеток для непрерывного брожения пива: обзор» . Журнал Института пивоварения . 104 (1): 19–31. дои : 10.1002/j.2050-0416.1998.tb00970.x . ISSN 2050-0416 .
- ^ Матаски, Маттиа; Хакер, Дэвид Л.; Балди, Люсия; Вурм, Флориан М. (1 сентября 2008 г.). «Продуцирование рекомбинантного терапевтического белка в культивируемых клетках млекопитающих: современное состояние и перспективы» . Открытие лекарств сегодня: технологии . Белковая терапия. 5 (2): е37–е42. дои : 10.1016/j.ddtec.2008.12.003 . ISSN 1740-6749 . ПМИД 24981089 .
- ^ Верпорте, Р.; ван дер Хейден, Р.; Мемелинк, Дж. (01 июля 2000 г.). «Инжиниринг завода растительных клеток по производству вторичных метаболитов» . Трансгенные исследования . 9 (4): 323–343. дои : 10.1023/А:1008966404981 . ISSN 1573-9368 . ПМИД 11131010 . S2CID 25185714 .
- ^ Скотт, Роберт И.; Бланшар, Джон Х.; Фергюсон, Клэр HR (1 октября 1992 г.). «Влияние кислорода на продукцию рекомбинантного белка суспензионными культурами клеток насекомых Spodoptera frugiperda (Sf-9)» . Ферментные и микробные технологии . 14 (10): 798–804. дои : 10.1016/0141-0229(92)90095-6 . ISSN 0141-0229 . ПМИД 1369406 .
- ^ admin.facellitate (08.06.2022). «Методы культивирования клеток in vitro: адгезивная культура против суспензионной культуры» . faCellitate . Проверено 29 ноября 2022 г.
- ^ Морейра, Ана София; Сильва, Ана Карина; Соуза, Маркос FQ; Хагнер-МакВиртерк, Оса; Аленц, Густав; Лундгрен, Матс; Корадинья, Ана С.; Алвес, Паула М.; Пейшото, Кристина; Каррондо, Мануэль Дж.Т. (апрель 2020 г.). «Создание суспензионных клеточных культур для улучшения производства онколитического аденовируса» . Биотехнологический журнал . 15 (4): e1900411. дои : 10.1002/biot.201900411 . ISSN 1860-7314 . ПМИД 31950598 . S2CID 210700489 .