Изоляция клеток

Выделение клеток — это процесс отделения отдельных живых клеток от твердого блока ткани или клеточной суспензии. Хотя некоторые типы клеток в природе существуют в отдельной форме (например, клетки крови ), другие типы клеток, обнаруженные в твердых тканях, требуют специальных методов для разделения их на отдельные клетки. Это можно сделать, используя ферменты для переваривания белков , которые связывают эти клетки вместе во внеклеточном матриксе . После переваривания белков матрикса клетки остаются слабо связанными друг с другом, но их можно аккуратно разделить механическим путем. После выделения на этих отдельных изолированных клетках можно проводить эксперименты, включая электрофизиологию патч-клампа , флуоресцентную визуализацию кальция и иммуноцитохимию .

Техники

Циркулирующие клетки

Методы, необходимые для получения изолированных клеток, различаются в зависимости от требуемого типа клеток. Циркулирующие клетки, такие как клетки крови или некоторые опухолевые клетки, можно выделить, взяв образец крови. ^[1] Поскольку образцы крови содержат смесь многих различных типов клеток, необходимо использовать метод разделения клеток на разные типы. Наиболее часто используемый для этого метод — проточная цитометрия , во время которой автоматический анализатор исследует узкий поток клеток. В одной из версий этого метода поток клеток освещается светом, и анализатор обнаруживает отраженный свет или флуоресценцию, прежде чем использовать эту информацию для быстрого перемещения интересующих клеток в камеру для сбора. ^[2]

Твердые ткани

При работе с твердыми тканями получение ткани для выделения клеток может оказаться более сложной задачей. Излишки человеческой ткани иногда можно получить во время плановой операции, например, образцы ушка правого предсердия часто вырезают и выбрасывают во время операции на открытом сердце, такой как операция аортокоронарного шунтирования . ^[3] Другие ткани, такие как образцы поджелудочной железы или мочевого пузыря, могут быть взяты для биопсии. Альтернативно, ткани животных часто получают путем умерщвления животного. ^[4]

После получения образца ткани его необходимо окружить или перфузировать раствором соответствующей температуры, содержащим соли и питательные вещества, необходимые для поддержания жизни клеток. Это может быть выполнено путем простого погружения ткани в раствор или может включать более сложные процедуры, такие как перфузия Лангендорфа . ^[3] Обычно используемые растворы включали модификации раствора Тироде или раствора Кребса и Хензелайта. Эти растворы содержат точные концентрации электролитов, включая натрий , калий , кальций , магний , фосфат , хлорид и глюкозу . Концентрации этих электролитов необходимо тщательно балансировать, обращая внимание на осмотическое давление. Кислотность раствора необходимо регулировать, часто используя буфер pH, такой как HEPES . Выделение клеток из некоторых тканей можно улучшить путем насыщения раствора кислородом. ^[3] На начальных стадиях перфузию тканей раствором, не содержащим кальция, особенно полезно при выделении кардиомиоцитов , так как отсутствие кальция вызывает отделение вставочных дисков . ^[5]

протеолитические ферменты Затем к раствору можно добавить . Ферменты, расщепляющие коллаген ( коллагеназы ), часто используются при выделении клеток сердца или мочевого пузыря. ^[3]^[4]^[6] ферменты общего назначения, которые переваривают многие виды белков ( протеазы ). Также можно использовать ^[3] При выделении клеток из ткани головного мозга могут потребоваться другие ферменты, расщепляющие ДНК (ДНКазы). ^[7]

Эти ферменты, помимо переваривания внеклеточного матрикса, могут также переваривать другие важные белки, необходимые для функционирования интересующих клеток. Если клетки подвергаются воздействию этих ферментов слишком долго, это приводит к гибели клеток, но если они не подвергаются воздействию ферментов достаточно долго, переваривание внеклеточного матрикса не будет полным. После удаления ферментов из ткани путем перфузии ее вторым раствором, не содержащим ферментов, клетки можно механически разделить или диссоциировать. Простой метод диссоциации клеток предполагает разрезание ткани на небольшие кусочки перед перемешиванием этих кусочков в растворе с помощью пипетки. ^[3]^[4]

Использование

Изолированные клетки можно использовать для изучения того, как они работают, как они изменяются в ответ на болезнь и как на них влияют лекарства. Примером экспериментальной техники, в которой используются изолированные клетки, является электрофизиология с использованием патч-клампа , используемая для изучения того, как заряженные частицы проходят через клеточную мембрану . Дополнительные методы включают флуоресцентную визуализацию кальция с использованием красителей, которые излучают свет в ответ на кальций для измерения того, как кальций регулируется внутри клетки, и иммуноцитохимию , которая использует антитела, помеченные флуоресцентным маркером, для определения местоположения белков внутри клетки. ^[8] Изолированные клетки также можно использовать для клеточной культуры , при которой одна клетка размножается для создания колонии клеток. ^[4]

Выделение клеток также можно использовать как часть лечения. Выделение островковых клеток поджелудочной железы с последующим их культивированием и трансплантацией используется для лечения пациентов с диабетом 1 типа . ^[9]

См. также

Сортировка ячеек

Ссылки

^ Бхагват Н., Карпентер Э.Л. (2017). «Проточные цитометрические методы выделения циркулирующих опухолевых клеток и молекулярного анализа». Выделение и молекулярная характеристика циркулирующих опухолевых клеток . Достижения экспериментальной медицины и биологии. Том. 994. стр. 105–118. дои : 10.1007/978-3-319-55947-6_5 . ISBN 978-3-319-55946-9 . ПМИД 28560670 .
^ Ху П., Чжан В., Синь Х., Дэн Г. (2016). «Выделение и анализ одиночных клеток» . Границы клеточной биологии и биологии развития . 4 : 116. дои : 10.3389/fcell.2016.00116 . ПМК 5078503 . ПМИД 27826548 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж Фойгт Н., Пирман К.М., Добрев Д., Дибб К.М. (сентябрь 2015 г.). «Методы выделения предсердных клеток крупных млекопитающих и человека» . Журнал молекулярной и клеточной кардиологии . 86 : 187–98. дои : 10.1016/j.yjmcc.2015.07.006 . ПМИД 26186893 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д Луч В.Е., Шихан К.А., Вольска Б.М. (сентябрь 2011 г.). «Методы выделения, культивирования и переноса генов кардиомиоцитов» . Журнал молекулярной и клеточной кардиологии . 51 (3): 288–98. дои : 10.1016/j.yjmcc.2011.06.012 . ПМК 3164875 . ПМИД 21723873 .
^ Йейтс Дж. К., Дхалла Н. С. (февраль 1975 г.). «Структурные и функциональные изменения, связанные с недостаточностью и восстановлением сердца после перфузии средой, не содержащей Са2+». Журнал молекулярной и клеточной кардиологии . 7 (2): 91–103. дои : 10.1016/0022-2828(75)90011-5 . ПМИД 1121035 .
^ Клосковски Т., Узарска М., Гуртовска Н., Ольковска Дж., Иоахимяк Р., Баек А., Гагат М., Гржанка А., Боднар М., Маршалек А., Древа Т. (апрель 2014 г.). «Как изолировать уротелиальные клетки? Сравнение четырех различных методов и обзор литературы». Человеческая клетка . 27 (2): 85–93. дои : 10.1007/s13577-013-0070-y . ПМИД 24368576 . S2CID 9966872 .
^ Чу Л.Дж., ДеБой К.А., Сенаторов В.В. (октябрь 2014 г.). «Определение степени разделения: экспериментальные подходы к выделению астроглиальных и олигодендроглиальных клеток и генетическому нацеливанию» . Журнал методов нейробиологии . 236 : 125–47. дои : 10.1016/j.jneumeth.2014.08.017 . ПМК 4171043 . ПМИД 25169049 .
^ Фрэнк, Дж.; Бисальски, Гонконг; Доминичи, С.; Помпелла, А. (январь 2000 г.). «Визуализация окислительного стресса в тканях и изолированных клетках». Гистология и гистопатология . 15 (1): 173–184. дои : 10.14670/HH-15.173 . ISSN 0213-3911 . ПМИД 10668208 .
^ Киффер Т.Дж., Волтьен К., Осафунэ К., Ябе Д., Инагаки Н. (октябрь 2017 г.). «Стратегии замены бета-клеток при диабете» . Журнал исследования диабета . 9 (3): 457–463. дои : 10.1111/jdi.12758 . ПМЦ 5934267 . ПМИД 28984038 .

Дальнейшее чтение

Выделение предсердных кардиомиоцитов: Фойгт Н., Пирман К.М., Добрев Д., Дибб К.М. (сентябрь 2015 г.). «Методы выделения предсердных клеток крупных млекопитающих и человека» . Журнал молекулярной и клеточной кардиологии . 86 : 187–98. дои : 10.1016/j.yjmcc.2015.07.006 . ПМИД 26186893 .
Выделение желудочковых кардиомиоцитов: Луч В.Е., Шихан К.А., Вольска Б.М. (сентябрь 2011 г.). «Методы выделения, культивирования и переноса генов кардиомиоцитов» . Журнал молекулярной и клеточной кардиологии . 51 (3): 288–98. дои : 10.1016/j.yjmcc.2011.06.012 . ПМК 3164875 . ПМИД 21723873 .
Выделение островковых клеток поджелудочной железы: Рикорди С., Лейси П.Е., Финке Э.Х., Олак Б.Дж., Шарп Д.В. (апрель 1988 г.). «Автоматизированный метод выделения островков поджелудочной железы человека». Диабет . 37 (4): 413–20. дои : 10.2337/diab.37.4.413 . ПМИД 3288530 . S2CID 20974701 .
Выделение гемопоэтических стволовых клеток: Ректор К., Лю Ю., Ван Зант Г. (2013 г.). «Комплексные методы выделения гемопоэтических стволовых клеток». Стволовые клетки и старение . Методы молекулярной биологии. Том. 976. стр. 1–15. дои : 10.1007/978-1-62703-317-6_1 . ISBN 978-1-62703-316-9 . ПМИД 23400430 .
Выделение мезенхимальных стволовых клеток: Йосупов Н., Хаимов Х., Юодзбалис Г. (2017). «Мобилизация, изоляция и характеристика стволовых клеток периферической крови: систематический обзор» . Журнал исследований полости рта и челюстно-лицевой области . 8 (1): е1. дои : 10.5037/jomr.2017.8101 . ПМЦ 5423306 . ПМИД 28496961 .
Выделение звездчатых клеток печени: Шан Л., Хоссейни М., Лю Х, Киселева Т., Бреннер Д.А. (январь 2018 г.). «Выделение и характеристика звездчатых клеток печени человека» . Журнал гастроэнтерологии . 53 (1): 6–17. дои : 10.1007/s00535-017-1404-4 . ПМИД 29094206 .
Выделение циркулирующих опухолевых клеток: Бхагват Н., Карпентер Э.Л. (2017). «Проточные цитометрические методы выделения циркулирующих опухолевых клеток и молекулярного анализа». Выделение и молекулярная характеристика циркулирующих опухолевых клеток . Достижения экспериментальной медицины и биологии. Том. 994. стр. 105–118. дои : 10.1007/978-3-319-55947-6_5 . ISBN 978-3-319-55946-9 . ПМИД 28560670 .
Выделение нейроглиальных клеток: Чу Л.Дж., ДеБой К.А., Сенаторов В.В. (октябрь 2014 г.). «Определение степени разделения: экспериментальные подходы к выделению астроглиальных и олигодендроглиальных клеток и генетическому нацеливанию» . Журнал методов нейробиологии . 236 : 125–47. дои : 10.1016/j.jneumeth.2014.08.017 . ПМК 4171043 . ПМИД 25169049 .
Выделение уротелиальных клеток: Клосковски Т., Узарска М., Гуртовска Н., Ольковска Дж., Иоахимяк Р., Баек А., Гагат М., Гржанка А., Боднар М., Маршалек А., Древа Т. (апрель 2014 г.). «Как изолировать уротелиальные клетки? Сравнение четырех различных методов и обзор литературы». Человеческая клетка . 27 (2): 85–93. дои : 10.1007/s13577-013-0070-y . ПМИД 24368576 . S2CID 9966872 .

[Bhagwat_2017-1] Бхагват Н., Карпентер Э.Л. (2017). «Проточные цитометрические методы выделения циркулирующих опухолевых клеток и молекулярного анализа». Выделение и молекулярная характеристика циркулирующих опухолевых клеток . Достижения экспериментальной медицины и биологии. Том. 994. стр. 105–118. дои : 10.1007/978-3-319-55947-6_5 . ISBN 978-3-319-55946-9 . ПМИД 28560670 .

[2] Ху П., Чжан В., Синь Х., Дэн Г. (2016). «Выделение и анализ одиночных клеток» . Границы клеточной биологии и биологии развития . 4 : 116. дои : 10.3389/fcell.2016.00116 . ПМК 5078503 . ПМИД 27826548 .

[Voigt_2015-3] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж Фойгт Н., Пирман К.М., Добрев Д., Дибб К.М. (сентябрь 2015 г.). «Методы выделения предсердных клеток крупных млекопитающих и человека» . Журнал молекулярной и клеточной кардиологии . 86 : 187–98. дои : 10.1016/j.yjmcc.2015.07.006 . ПМИД 26186893 .

[Louch_2011-4] Jump up to: ^а ^б ^с ^д Луч В.Е., Шихан К.А., Вольска Б.М. (сентябрь 2011 г.). «Методы выделения, культивирования и переноса генов кардиомиоцитов» . Журнал молекулярной и клеточной кардиологии . 51 (3): 288–98. дои : 10.1016/j.yjmcc.2011.06.012 . ПМК 3164875 . ПМИД 21723873 .

[5] Йейтс Дж. К., Дхалла Н. С. (февраль 1975 г.). «Структурные и функциональные изменения, связанные с недостаточностью и восстановлением сердца после перфузии средой, не содержащей Са2+». Журнал молекулярной и клеточной кардиологии . 7 (2): 91–103. дои : 10.1016/0022-2828(75)90011-5 . ПМИД 1121035 .

[Kloskowski_2014-6] Клосковски Т., Узарска М., Гуртовска Н., Ольковска Дж., Иоахимяк Р., Баек А., Гагат М., Гржанка А., Боднар М., Маршалек А., Древа Т. (апрель 2014 г.). «Как изолировать уротелиальные клетки? Сравнение четырех различных методов и обзор литературы». Человеческая клетка . 27 (2): 85–93. дои : 10.1007/s13577-013-0070-y . ПМИД 24368576 . S2CID 9966872 .

[Chew_2014-7] Чу Л.Дж., ДеБой К.А., Сенаторов В.В. (октябрь 2014 г.). «Определение степени разделения: экспериментальные подходы к выделению астроглиальных и олигодендроглиальных клеток и генетическому нацеливанию» . Журнал методов нейробиологии . 236 : 125–47. дои : 10.1016/j.jneumeth.2014.08.017 . ПМК 4171043 . ПМИД 25169049 .

[8] Фрэнк, Дж.; Бисальски, Гонконг; Доминичи, С.; Помпелла, А. (январь 2000 г.). «Визуализация окислительного стресса в тканях и изолированных клетках». Гистология и гистопатология . 15 (1): 173–184. дои : 10.14670/HH-15.173 . ISSN 0213-3911 . ПМИД 10668208 .

[9] Киффер Т.Дж., Волтьен К., Осафунэ К., Ябе Д., Инагаки Н. (октябрь 2017 г.). «Стратегии замены бета-клеток при диабете» . Журнал исследования диабета . 9 (3): 457–463. дои : 10.1111/jdi.12758 . ПМЦ 5934267 . ПМИД 28984038 .

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]