Массивно-параллельная последовательность подписей
 | В этой статье есть несколько проблем. Пожалуйста, помогите улучшить его или обсудите эти проблемы на странице обсуждения . ( Узнайте, как и когда удалять эти шаблонные сообщения )
|
Массивное параллельное секвенирование сигнатур ( MPSS ) — это процедура, которая используется для идентификации и количественной оценки транскриптов мРНК , в результате чего получаются данные, аналогичные последовательному анализу экспрессии генов (SAGE), хотя в ней используется ряд секвенирования существенно отличающихся биохимических этапов и этапов .
Как это работает
[ редактировать ]MPSS — это метод определения уровней экспрессии мРНК путем подсчета количества отдельных молекул мРНК, продуцируемых каждым геном. Он является «открытым» в том смысле, что идентичность измеряемых РНК не определяется заранее, как в случае с микроматрицами для экспрессии генов .
Образец мРНК сначала преобразуется в комплементарную ДНК ( кДНК ) с помощью обратной транскриптазы , что облегчает последующие манипуляции. Эта кДНК слита с небольшой олигонуклеотидной «меткой», которая позволяет амплифицировать кДНК с помощью ПЦР и затем соединить ее с микрошариками. После нескольких раундов определения последовательности с использованием гибридизации флуоресцентно-меченых зондов для каждой бусины определяют сигнатуру последовательности размером ~ 16–20 п.н. Флуоресцентная визуализация улавливает сигнал от всех шариков, прикрепленных к двумерной поверхности, поэтому последовательности ДНК определяются на всех шариках параллельно. Происходит некоторая амплификация исходного материала, поэтому в конечном итоге за эксперимент получается примерно 1 000 000 прочтений последовательности. [1]
Обзор
[ редактировать ]MPSS позволяет мРНК идентифицировать транскрипты путем создания сигнатурной последовательности длиной 17–20 п.о. ( пара оснований ), примыкающей к 3'-концу самого 3'-сайта указанного фермента рестрикции (обычно Sau3A или DpnII ). Каждая сигнатурная последовательность клонируется на одну из миллиона микрогранул . только один тип последовательности ДНК Этот метод гарантирует, что на микрогранулах присутствует . Таким образом, если в биологическом образце имеется 50 копий определенного транскрипта, эти транскрипты будут зафиксированы на 50 различных микрогранулах, каждая из которых будет содержать примерно 100 000 амплифицированных копий конкретной сигнатурной последовательности. Затем микрогранулы помещают в проточную ячейку для секвенирования и количественного определения. Сигнатуры последовательности расшифровываются путем параллельной идентификации четырех оснований путем гибридизации с флуоресцентно меченными кодировщиками (рис. 5). Каждый из кодировщиков имеет уникальную метку, которая обнаруживается после гибридизации путем получения изображения массива микрошариков. Следующим шагом будет расщепление и удаление этого набора из четырех оснований и раскрытие следующих четырех оснований для нового раунда гибридизации с кодировщиками и получением изображений. Необработанный результат представляет собой список сигнатурных последовательностей длиной 17–20 пар оснований, которые можно аннотировать к геному человека для идентификации генов.
Сравнение с SAGE
[ редактировать ]Более длинная последовательность меток обеспечивает более высокую специфичность, чем классическая метка SAGE длиной 9–10 пар оснований . Уровень уникальной экспрессии генов представлен количеством транскриптов, присутствующих на миллион молекул, аналогично данным SAGE. Существенным преимуществом является больший размер библиотеки по сравнению с SAGE. Библиотека MPSS обычно содержит 1 миллион тегов подписи, что примерно в 20 раз больше размера библиотеки SAGE. Некоторые недостатки, связанные с SAGE, применимы и к MPSS, например, потеря определенных транскриптов из-за отсутствия сайта узнавания рестриктаз и двусмысленность в аннотации тегов. Высокая чувствительность и абсолютная экспрессия генов, безусловно, благоприятствуют MPSS. Однако эта технология доступна только через компанию Lynxgen Therapeutics, Inc. (затем Solexa Inc до 2006 года, а затем Illumina ).
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Группа Шулер. «Массивно-параллельное секвенирование подписей (MPSS)» .
Дальнейшее чтение
[ редактировать ]- Бреннер, Сидней; Джонсон, Мария; Бриджем, Джон; Голда, Джордж; Ллойд, Дэвид Х.; Джонсон, Давида; Ло, Шуцзюнь; Маккарди, Сара; и др. (2000). «Анализ экспрессии генов с помощью массово-параллельного сигнатурного секвенирования (MPSS) на массивах микрогранул». Природная биотехнология . 18 (6): 630–4. дои : 10.1038/76469 . ПМИД 10835600 . S2CID 13884154 .
- Найгаард, В; Ховиг, Э (2009). «Методы количественного определения экспрессии генов» . Границы бионауки . 14 (14): 552–69. дои : 10.2741/3262 . ПМИД 19273085 .
- Рейнартц, Дж; Брюинс, Э; Лин, Джей Зи; и др. (февраль 2002 г.). «Массивно-параллельное сигнатурное секвенирование (MPSS) как инструмент для углубленного количественного профилирования экспрессии генов во всех организмах» . Краткая функция геномной протеомики . 1 : 95–104. дои : 10.1093/bfgp/1.1.95 . ПМИД 15251069 .
- Торрес, ТТ; Метта, М; Оттенвальдер, Б; Шлёттерер, К. (январь 2008 г.). «Профилирование экспрессии генов с помощью массового параллельного секвенирования» . Геном Рез . 18 (1): 172–7. дои : 10.1101/гр.6984908 . ПМК 2134766 . ПМИД 18032722 .