Многоугольное рассеяние света

Многоугольное рассеяние света ( MALS ) описывает метод измерения света , рассеянного образцом под множеством углов. Он используется для определения как абсолютной молярной массы , так и среднего размера молекул в растворе путем определения того, как они рассеивают свет . лазерного Чаще всего используется коллимированный луч , источника и в этом случае метод можно назвать многоугловым рассеянием лазерного света ( MALLS ). Вставка слова «лазер» была призвана успокоить тех, кто привык проводить измерения рассеяния света с помощью обычных источников света, таких как ртутные дуговые лампы , в том, что теперь можно проводить измерения под малым углом. До появления лазеров и связанных с ними тонких лучей узкой ширины ширина обычных световых лучей, используемых для таких измерений, не позволяла собирать данные при меньших углах рассеяния. В последние годы, поскольку все коммерческие приборы светорассеяния используют лазерные источники, от необходимости упоминать источник света отказались, и повсюду используется термин MALS.

Термин «многоракурсный» относится к обнаружению рассеянного света под разными дискретными углами, измеренному, например, с помощью одного детектора, перемещаемого в диапазоне, который включает в себя выбранные конкретные углы, или массива детекторов, зафиксированных в определенных угловых положениях. обсуждение физического явления, связанного с этим статическим рассеянием света Представлено , включая некоторые приложения, методы анализа данных и связанные с ними графические представления.

Предыстория

Измерение рассеянного света от освещенного образца составляет основу так называемого классического измерения рассеяния света . Исторически такие измерения проводились с использованием одного детектора. вращается по дуге вокруг освещенного образца. Первым коммерческим прибором (формально называемым «фотометром рассеянного света») был фотометр рассеяния света Брайса-Феникса, представленный в середине 1950-х годов, за которым последовал фотометр Софики, представленный в конце 1960-х годов.

Измерения обычно выражались как рассеянная интенсивность или рассеянная освещенность. Поскольку сбор данных производился, когда детектор размещался в разных местах дуги, причем каждое положение соответствовало разному углу рассеяния, концепция размещения отдельного детектора в каждом интересующем угловом месте был хорошо понятен, хотя и не реализован на коммерческой основе до конца 1970-х годов. Несколько детекторов, имеющих разную квантовую эффективность, имеют разный отклик и, следовательно, их необходимо нормализовать в этой схеме. Интересную систему, основанную на использовании высокоскоростной пленки, разработали Брунстинг и Маллани. в 1974 году. Это позволило записать на пленку весь диапазон рассеянных интенсивностей с последующим сканированием денситометром , позволяющим получить относительные рассеянные интенсивности. Традиционное в то время использование одного детектора, вращающегося вокруг освещенного образца с интенсивностью, собранной под определенными углами, называлось дифференциальным рассеянием света. после квантовомеханического термина дифференциальное сечение , σ(θ) выражается в миллибарнах/стерадианах. Измерения дифференциальных сечений обычно проводились, например, для изучения структуры атомного ядра путем рассеяния на нем нуклонов. например, нейтроны . Важно различать дифференциальное рассеяние света и динамическое рассеяние света , оба из которых обозначаются инициалами DLS. Последнее относится к совершенно иной методике, измеряющей колебания рассеянного света из-за конструктивной и деструктивной интерференции, причем частота связана с тепловым движением, броуновским движением молекул или частиц в растворе или суспензии.

Измерение MALS требует набора вспомогательных элементов. Наиболее важным среди них является коллимированный или сфокусированный луч света (обычно от лазерного источника, создающего коллимированный луч монохроматического света), который освещает область образца. В современных приборах луч обычно плоскополяризован, перпендикулярен плоскости измерения, хотя могут использоваться и другие поляризации, особенно при изучении анизотропных частиц. Более ранние измерения, до появления лазеров, проводились с использованием сфокусированных, хотя и неполяризованных, световых лучей от таких источников, как ртутные дуговые лампы. Другим необходимым элементом является оптическая ячейка для хранения измеряемого образца. В качестве альтернативы можно использовать ячейки, включающие средства, позволяющие измерять текущие образцы. Если необходимо измерить свойства рассеяния одиночных частиц, необходимо предусмотреть средство для введения таких частиц по одной через световой луч в точке, обычно равноудаленной от окружающих детекторов.

Хотя большинство измерений на основе MALS выполняются в плоскости, содержащей набор детекторов, обычно расположенных на равном расстоянии от расположенного в центре образца, через который проходит освещающий луч, трехмерные версии также были разработаны, в которых детекторы располагаются на поверхности сферы, а образец контролируется так, чтобы проходить через ее центр, где он пересекает путь падающего светового луча, проходящего по диаметру сферы. Бывшие рамки используется для измерения аэрозольных частиц, тогда как последний использовался для изучения морских организмов, таких как фитопланктон .

Традиционное измерение дифференциального рассеяния света было практически идентично используемому в настоящее время методу MALS. Хотя метод MALS обычно собирает мультиплексированные данные последовательно с выходов набора дискретных детекторов, более раннее измерение дифференциального рассеяния света также собирало данные последовательно, когда одиночный детектор перемещался от одного угла сбора к другому. Реализация MALS, конечно, намного быстрее, но собираются и интерпретируются одни и те же типы данных. Таким образом, эти два термина относятся к одному и тому же понятию. Для измерений дифференциального светорассеяния фотометр светорассеяния имеет один детектор, тогда как фотометр светорассеяния MALS обычно имеет множество детекторов.

Другой тип устройства MALS был разработан в 1974 году Зальцманном и др. на основе детектора световых образов, изобретенного Джорджем и др. для Litton Systems Inc. в 1971 году. Детектор Литтона был разработан для отбора проб распределения световой энергии в задней фокальной плоскости сферической линзы для отбора проб геометрических соотношений и распределения спектральной плотности объектов, записанных на пленочных пленках.

Применение детектора Литтона Зальцмана и др. обеспечил измерение при 32 малых углах рассеяния от 0° до 30° и усреднение по широкому диапазону азимутальных углов, поскольку наиболее важными углами являются передние углы статического рассеяния света. К 1980 году Бартоли и др. разработал новый подход к измерению рассеяния под дискретными углами рассеяния с использованием эллиптического отражателя, позволяющий проводить измерения под 30 полярными углами в диапазоне 2,5 ° ≤ θ ≤ 177,5 ° с разрешением 2,1 °.

Коммерциализация многоугольных систем началась в 1977 году, когда компания Science Spectrum, Inc. запатентовал проточную капиллярную систему для индивидуальной системы биоанализа, разработанной для USFDA . Первый коммерческий прибор MALS, включающий 8 дискретных детекторов, был поставлен компании SC Johnson and Son компанией Wyatt Technology в 1983 году. за этим последовала продажа в 1984 году первого расходомера с 15 детекторами (Рассвет-Ф). в АМОКО. К 1988 году была представлена ​​трехмерная конфигурация. специально для измерения рассеивающих свойств одиночных аэрозольных частиц. Примерно в то же время был построен подводный прибор для измерения свойств рассеянного света одиночного фитопланктона. Сигналы собирались по оптическим волокнам и передавались на отдельные фотоумножители. Примерно в декабре 2001 года был коммерциализирован прибор, измеряющий 7 углов рассеяния с помощью ПЗС- детектора (BI-MwA: Brookhaven Instruments Corp, Хотлсвилл, Нью-Йорк).

Литература, посвященная измерениям фотометрами MALS, обширна. как в отношении периодических измерений частиц/молекул, так и в отношении измерений после фракционирования с помощью хроматографических средств, таких как эксклюзионная хроматография. (SEC), обращенно-фазовая хроматография (RPC) и фракционирование полевого потока (ФФФ).

Теория

Интерпретация измерений рассеяния, выполненных в многоугольных точках, основана на некотором знании априорных свойств измеряемых частиц или молекул. Рассеивающие характеристики различных классов таких рассеивателей лучше всего можно интерпретировать с помощью соответствующей теории. Например, чаще всего применяются следующие теории.

Рэлеевское рассеяние является самым простым и описывает упругое рассеяние света или другого электромагнитного излучения объектами, размер которых намного меньше длины волны падающего излучения. Этот тип рассеяния отвечает за голубой цвет неба в течение дня и обратно пропорционален четвертой степени длины волны.

Приближение Рэлея -Ганса является средством интерпретации измерений MALS в предположении, что рассеивающие частицы имеют показатель преломления n ₁ , очень близкий к показателю преломления окружающей среды n ₀ . Если мы положим m = n ₁ /n ₀ и предположим, что |m - 1| << 1 , то такие частицы можно рассматривать как состоящие из очень маленьких элементов, каждый из которых можно представить как частицу, рассеивающую Рэлея. Таким образом, предполагается, что каждый маленький элемент более крупной частицы рассеивается независимо от любого другого.

Лоренц-Ми теория используется для интерпретации рассеяния света однородными сферическими частицами. Приближение Рэлея–Ганса и теория Лоренца–Ми дают идентичные результаты для однородных сфер в пределе |1 − m | → 0 .

Теорию Лоренца-Ми можно обобщить на сферически-симметричные частицы по ссылке. Эрма рассмотрела более общие формы и структуры.

Данные рассеяния обычно представляются в терминах так называемого избыточного коэффициента Рэлея, определяемого как коэффициент Рэлея раствора или единичного события частицы, из которого вычитается коэффициент Рэлея самой жидкости-носителя и другие фоновые вклады, если таковые имеются. Коэффициент Рэлея, измеренный на детекторе, расположенном под углом θ и стягивающем телесный угол ΔΩ, определяется как интенсивность света на единицу телесного угла на единицу падающей интенсивности, I ₀ , на единицу освещенного объема рассеяния ΔV . Объем рассеяния ΔV, из которого рассеянный свет достигает детектора, определяется полем зрения детектора, обычно ограниченным апертурами, линзами и диафрагмами. Рассмотрим теперь измерение MALS, выполненное в плоскости суспензии N идентичных частиц/молекул на мл, освещенной тонким лучом света, создаваемым лазером. Предполагая, что свет поляризован перпендикулярно плоскости детекторов. Интенсивность рассеянного света, измеренная детектором под углом θ, превышающим интенсивность рассеяния суспендирующей жидкостью, будет равна

$I(\theta )={\frac {I_{0}N\Delta V}{(kr)^{2}}}i(\theta )$,

где i(θ) — функция рассеяния одиночной частицы, k = 2πn ₀ /λ ₀ , n ₀ — показатель преломления суспендирующей жидкости, а λ ₀ — вакуумная длина волны падающего света. Избыточный коэффициент Рэлея R(θ) тогда определяется выражением

$R(\theta )={\frac {I(\theta )r^{2}}{I_{0}\Delta V}}=Ni(\theta )/k^{2}$.

Даже для простой однородной сферы радиуса a, показатель преломления которой n почти такой же, как показатель преломления n ₀ суспендирующей жидкости, т. е. приближение Рэлея-Ганса, функция рассеяния в плоскости рассеяния является относительно сложной количество

$i(\theta )={\frac {k^{2}V^{2}\left|{m-1}\right|^{2}}{4\pi ^{2}}}G^{2}\left({2ka\sin {\frac {\theta }{2}}}\right)$, где

$G(\xi )={\frac {3}{\xi ^{2}}}(\sin \xi -\xi \cos \xi )$,    $k={\frac {2\pi n_{0}}{\lambda _{0}}}$,     $V={\frac {4}{3}}\pi a^{3}$

- λ ₀ длина волны падающего света в вакууме.

Приложения

График Зимма и пакетный сбор

Сюжет Зимма

MALS чаще всего используется для характеристики массы и размера молекул в растворе. Ранние реализации MALS, такие как те, которые обсуждались Бруно Х. Зиммом в его статье «Приборы и методы для измерения и интерпретации углового изменения рассеяния света; предварительные результаты по растворам полистирола». предполагает использование одного детектора, вращающегося вокруг образца, содержащегося в прозрачном сосуде. Измерения MALS на таких нетекучих образцах обычно называют «периодическими измерениями». Создавая образцы с несколькими известными низкими концентрациями и обнаруживая рассеянный вокруг образца свет под разными углами, можно построить график Зимма. путем построения графика: ${\frac {K^{*}c}{R_{\theta }}}$ против $\sin ^{2}{\frac {\theta }{2}}+kc$ где c — концентрация образца, а k — коэффициент растяжения, используемый для определения kc и $\sin ^{2}{\frac {\theta }{2}}$ в том же числовом диапазоне.

При построении графика можно экстраполировать как на нулевой угол, так и на нулевую концентрацию, и анализ графика даст среднеквадратичный радиус молекул образца из начального наклона линии c = 0 и молярную массу молекулы в точке, где оба концентрация и угол равны нулю. Усовершенствования графика Зимма, которые включают все собранные данные (обычно называемые «глобальным соответствием»), в значительной степени заменили график Зимма в современных пакетных анализах.

SEC и режим потока

Сигналы MALS для полистироловых сфер

С появлением эксклюзионной хроматографии (SEC) измерения MALS стали использоваться в сочетании с онлайн-детектором концентрации для определения абсолютной молярной массы и размера фракций образца, элюируемых из колонки, а не в зависимости от методов калибровки. Эти измерения MALS в проточном режиме были распространены на другие методы разделения, такие как фракционирование в полевом потоке , ионообменная хроматография и обращенно-фазовая хроматография .

Угловая зависимость данных светорассеяния показана ниже на рисунке смеси полистироловых сфер, разделенных методом SEC. Два самых маленьких образца (крайние справа) элюировались последними и не показывают угловой зависимости. Образец, второй справа, демонстрирует линейное угловое изменение с увеличением интенсивности при меньших углах рассеяния. Самый крупный образец слева элюируется первым и демонстрирует нелинейное угловое изменение.

Полезность

Молярная масса и размер

Разделение BSA и распределение ММ

Соединение MALS со встроенным детектором концентрации после средства разделения проб, такого как SEC, позволяет рассчитать молярную массу элюируемого образца в дополнение к его среднеквадратичному радиусу. На рисунке ниже показано хроматографическое разделение агрегатов БСА. Показаны сигнал рассеяния света под углом 90° от детектора MALS и значения молярной массы для каждого среза элюата.

Молекулярные взаимодействия

Поскольку MALS может определить молярную массу и размер молекул, он позволяет изучать связывание белок-белок, олигомеризацию и кинетику самосборки, ассоциации и диссоциации. Сравнивая молярную массу образца с его концентрацией, можно определить сродство связывания и стехиометрию взаимодействующих молекул.

и

Коэффициент разветвления полимера относится к числу разветвлений в случайно разветвленном полимере и количеству плеч в звездообразно разветвленных полимерах и был определен Зиммом и Стокмайером как

$g={\frac {R_{b}^{2}}{R_{l}^{2}}}$

Где $R^{2}$ – средний квадрат радиуса разветвленных и линейных макромолекул с одинаковой молярной массой. Используя MALS в сочетании с детектором концентрации, как описано выше, можно создать логарифмический график зависимости среднеквадратичного радиуса от молярной массы. Наклон этого графика дает коэффициент ветвления g.

Помимо разветвления, логарифмический график зависимости размера от молярной массы указывает на форму или конформацию макромолекулы. Увеличение наклона графика указывает на изменение конформации полимера от сферической до хаотично-клубковой и линейной. Объединение среднеквадратичного радиуса MALS с гидродинамическим радиусом. $r_{h}$ полученный в результате измерений ДРС, дает коэффициент формы ρ = ${\frac {r_{g}}{r_{h}}}$, для каждой фракции размера макромолекул.

Другие приложения

Другие приложения MALS включают определение размера наночастиц , исследования агрегации белков , белок-белковых взаимодействий , электрофоретической подвижности или зета-потенциала. Методы MALS были приняты для изучения стабильности фармацевтических препаратов и их использования в наномедицине .