Бактериальная одногибридная система

Рисунок 1: Обзор бактериальной **одногибридной системы** . Библиотека рандомизированных нуклеотидов, представляющих потенциальные сайты связывания факторов транскрипции (10–20 пар оснований), «добычу», клонируется выше HIS3 и URA3, положительных и отрицательных селектируемых маркеров соответственно. Если фактор транскрипции связывается со рандомизированной областью, он будет рекрутировать РНК-полимеразу путем прямого слияния с α- или ω-субъединицей и, таким образом, активировать транскрипцию нижестоящих репортерных генов. Используемый штамм-хозяин E. coli не должен содержать бактериальных гомологов этих биосинтетических генов (HIS3 и URA3).

Бактериальная одногибридная система (B1H) представляет собой метод идентификации специфичного для последовательности целевого сайта ДНК-связывающего домена . В этой системе данный фактор транскрипции (TF) экспрессируется как слияние с субъединицей РНК-полимеразы . Параллельно библиотеку рандомизированных олигонуклеотидов, представляющих потенциальные целевые последовательности TF, клонируют в отдельный вектор, содержащий селектируемые гены HIS3 и URA3 . Если ДНК-связывающий домен (приманка) связывается с потенциальным сайтом-мишенью ДНК (жертвой) in vivo , он привлекает РНК-полимеразу к промотору и активирует транскрипцию репортерных генов в этом клоне. Два репортерных гена, HIS3 и URA3, позволяют осуществлять положительный и отрицательный отбор соответственно. В конце процесса положительные клоны секвенируются и исследуются с помощью инструментов поиска мотивов, чтобы определить предпочтительную целевую последовательность ДНК. ^{[ 1 ]}

Введение

Во всех живых организмах регуляция экспрессии генов контролируется взаимодействиями между ДНК-связывающими регуляторными белками (факторами транскрипции) и цис-регуляторными элементами , последовательностями ДНК внутри или вокруг генов, которые действуют как сайты-мишени для ДНК-связывающих белков. Связываясь с цис-регуляторными последовательностями и друг с другом, факторы транскрипции точно настраивают уровни транскрипции путем стабилизации/дестабилизации связывания РНК-полимеразы с промотором гена. Но, несмотря на их важность и повсеместное распространение, мало что известно о том, где именно связывается каждый из этих регуляторных белков. Литература предполагает, что почти 8% генов человека кодируют факторы транскрипции, а функции и особенности их взаимодействия остаются в значительной степени неизученными. ^{[ 2 ]} Мы находимся на пороге сближения высокопроизводительных технологий и теории генома, что позволит исследователям начать картировать эти взаимодействия в масштабе всего генома. Лишь недавно была предпринята попытка полного исследования особенностей связывания ДНК для большого семейства ДНК-связывающих доменов. B1H — лишь один из многих новых методов, полезных для изучения взаимодействий белок-ДНК. ^{[ 3 ]}

Обзор метода

Рисунок 2. Одногибридная система бактерий требует двух адаптированных плазмид: (а) вектор-приманка (pB1H1 или pB1H2), который экспрессирует ДНК-связывающий домен в виде слитой конструкции с субъединицей (α или ω) РНК-полимеразы, и (б) репортерную плазмиду (pH3U3), содержащую селектируемые маркеры и библиотеку сайтов связывания, или «добычу», которая потенциально будет взаимодействовать с «приманкой».

трансформация бактериального хозяина двумя разными плазмидами Требуется . Один из них предназначен для экспрессии интересующего ДНК-связывающего белка в виде слитой конструкции с субъединицей РНК-полимеразы (приманкой). Другая плазмида содержит область рандомизированной последовательности, представляющую потенциальные сайты связывания (жертву), которая, если она связана с химерным продуктом слияния, стимулирует экспрессию нижестоящих репортерных генов. Эта репортерная область способствует как положительному, так и отрицательному отбору с помощью HIS3 и URA3 соответственно, что вместе позволяет изолировать жертву, содержащую истинную целевую последовательность ДНК. HIS3 и URA3 кодируют белки, необходимые для биосинтеза гистидина и урацила.

Использование отрицательного селектируемого маркера имеет решающее значение для значительного снижения частоты ложноположительных результатов. Самоактивирующуюся добычу, где рандомизированная область способствует экспрессии репортера в отсутствие связывания TF, удаляют путем трансформации библиотеки репортерных векторов в бактерии в отсутствие приманки и анализа роста на чашках, содержащих 5-фтороротовую кислоту (5- ФОА). Белковый продукт URA3 превращает 5-FOA в токсичное соединение, тем самым позволяя выжить только тем колониям, которые содержат репортерные векторы, которые не являются самоактивирующими. Негативный отбор обычно предшествует положительному отбору, так что меньшая, очищенная библиотека жертв может быть подвергнута более строгому процессу положительного отбора. При трансформации очищенной библиотеки жертв плазмидой-приманкой положительная селекция достигается путем выращивания E. coli- хозяина на минимальной среде без гистидина (селективная среда NM), которая обычно дополняется различными концентрациями 3-аминотриазола (3-AT ), конкурентный ингибитор HIS3. HIS3 кодирует белок, необходимый для биосинтеза гистидина, и, таким образом, только те клетки, которые содержат комбинации «приманка-жертва», которые активируют репортерные гены, смогут расти. Манипулирование концентрациями 3-АТ позволяет охарактеризовать строгость связывания. Таким образом, исследователи могут оценить, насколько сильно приманка связывает свою жертву (коррелирует с уровнем экспрессии HIS3) и, таким образом, определить, какие сайты связывания нуклеотидов имеют сильные или слабые предпочтения для данного основания. Другими словами, если клетки могут расти, несмотря на высокую концентрацию 3-АТ, связывание приманка-жертва должно быть достаточно жестким, чтобы стимулировать экспрессию репортерного гена (HIS3) на достаточном уровне, чтобы преодолеть возникающее в результате конкурентное ингибирование. Наконец, положительные клоны секвенируют и исследуют с помощью уже существующих инструментов поиска мотивов (например, MEME, BioProspector). ^{[ 3 ]}

История метода

Одногибридная система бактерий претерпела многочисленные модификации с момента ее создания в 2005 году. ^{[ 3 ]} В конечном итоге она возникла как вариант двухгибридной системы бактерий, задуманной в 2000 году, которая сама была вдохновлена дрожжевыми одно- и двухгибридными системами. ^{[ 4 ]} В то время как двухгибридные версии могут оценивать как белок-белковые взаимодействия , так и белок-ДНК-взаимодействия, одногибридная система специализируется на последнем. Система B1H Менга и др. отличается от двухгибридной версии в двух ключевых отношениях. Он использует рандомизированную библиотеку добычи, состоящую из множества (<2x10 ⁸) уникальные потенциальные целевые последовательности, а также добавляет этап отрицательного отбора для очистки этой библиотеки от самоактивирующихся клонов. ^{[ 1 ]}^{[ 3 ]} Хотя эти идеи были заимствованы из исходной дрожжевой одногибридной системы, ^{[ 5 ]} до 2005 года они еще не применялись к бактериальному хозяину. По мере роста популярности метода исследователи вносили поправки в свои протоколы, чтобы улучшить систему B1H. В последнее время предпочтение отдается созданию слитой конструкции (приманки) с омега-, а не альфа-субъединицей РНК-полимеразы с целью улучшения стереохимии и динамического диапазона химеры. ^{[ 6 ]} Домен цинкового пальца в слитой конструкции и соответствующий ему сайт-мишень ДНК, расположенный рядом с рандомизированной последовательностью жертвы, также были добавлены для увеличения аффинности и специфичности взаимодействий белок-ДНК. Эта повышенная общая аффинность связывания позволяет охарактеризовать даже те белки ДНК-связывающего домена, которые слабо взаимодействуют с целевой последовательностью. ^{[ 7 ]}

Рисунок 3: Обзор отрицательного B1H и процедуры положительного отбора. Сегмент ДНК, помеченный как «RR», относится к рандомизированной области векторов-жертв. Самоактивирующиеся последовательности удаляются из исходной библиотеки сайтов связывания при попытке вырастить E.coli, трансформированную добычей, на среде, содержащей 5-FOA, соединение, которое расщепляется до токсина с помощью URA3. Полученную очищенную библиотеку-жертву затем трансформируют плазмидой-приманкой и выращивают на минимальной среде, не содержащей гистидин, для положительной селекции активно экспрессируемых репортерных векторов. Эта среда дополнена различными концентрациями 3-АТ, конкурентного ингибитора HIS3, для выяснения сродства связывания транскрипционного фактора с каждой конкретной целевой последовательностью. Затем рандомизированные области из выживших колоний изолируют и секвенируют перед анализом по поиску мотивов (например, MEME, BioProspector). Наконец, генерируются оптимальные и переносимые основания в ключевых положениях сайта связывания.

.

Преимущества

Система B1H имеет значительные преимущества перед другими методами исследования взаимодействий белок-ДНК. микрочипа Считывание результатов иммунопреципитации хроматина с помощью ( ChIP-чип ) для высокопроизводительного определения сайта связывания основано на специфических антителах, которые не всегда могут быть доступны. Методы, основанные на микрочипах, связывающих белки, также требуют дополнительных этапов очистки белков, которые не требуются в системе B1H. Более того, эти методы на основе микрочипов часто являются непомерно высокими с точки зрения необходимости использования специального оборудования и опыта для анализа полученных данных. SELEX , еще одна система, обычно используемая для идентификации нуклеиновых кислот-мишеней для ДНК-связывающих белков, требует нескольких раундов отбора. Напротив, бактериальная одногибридная система требует всего одного раунда отбора in vitro и также предлагает низкотехнологичную альтернативу технологиям на основе микрочипов. Для изучения взаимодействий ДНК-связывающих белков в системе B1H антитела не требуются. Еще одним преимуществом является то, что система B1H работает не только с мономерными белками, но и с белками, которые связывают ДНК в виде комплексов. Систему B1H следует рассматривать как специализированный метод изучения ДНК-белковых взаимодействий, тогда как двухгибридные варианты ( B2H и Y2H ) могут оценивать как белок-белковые, так и белок-ДНК взаимодействия. Эти двухгибридные системы являются многоцелевыми, но ограничены с точки зрения анализа только одной «жертвенной» библиотеки. Преимущество бактериальной одногибридной системы перед дрожжевой одногибридной системой (Y1H) заключается в более высокой эффективности трансформации плазмид в бактерии, что позволяет исследовать более сложные «жертвенные» библиотеки. ^{[ 1 ]}^{[ 3 ]}

Ограничения

Несмотря на вышеупомянутые преимущества в качестве специализированного инструмента, система B1H имеет некоторые недостатки. Во-первых, система селекции B1H ограничена в своей способности определять специфичность связывания транскрипционных факторов с длинными сайтами связывания. Это происходит из-за того, что количество рандомизированных «жертвенных» клонов, необходимых для представления всех возможных целевых последовательностей, увеличивается экспоненциально с увеличением количества нуклеотидов в этой целевой последовательности. Во-вторых, некоторые эукариотические факторы могут неэффективно экспрессироваться или сворачиваться в бактериальной системе, что связано с различными регуляторными сетями и механизмами транскрипции. Следовательно, при работе с ДНК-связывающими белками эукариотического происхождения гибридная система на основе дрожжей может оказаться полезной. В-третьих, система B1H может не идеально подходить для транскрипционных факторов, которые распознают сайты связывания с низким сродством. Логика здесь в том, что конкуренция, создаваемая сайтами связывания в других частях бактериального генома, может ограничивать сигнал, который может быть реализован от одного сайта связывания, который присутствует выше репортера. ^{[ 1 ]}^{[ 3 ]}

Приложение

Система B1H представляет собой инструмент в нашем арсенале для выявления особенностей связывания ДНК факторов транскрипции и, таким образом, для прогнозирования их целевых генов и регуляторных элементов геномной ДНК. Это также позволяет изучить влияние белок-белковых взаимодействий на связывание ДНК, что может в дальнейшем способствовать прогнозированию цис-регуляторных модулей на основе кластеризации сайтов связывания. Более того, система отбора B1H имеет значение для прогнозирования регуляторной роли ранее не охарактеризованных транскрипционных факторов. ^{[ 1 ]}

Конкретные примеры

Используя бактериальную одногибридную систему, одно исследование охарактеризовало 35 членов сети сегментации Drosophila melanogaster, которая включает представителей всех основных классов белков ДНК-связывающего домена. ^{[ 8 ]} Значение для медицинских исследований очевидно из другого исследования, в котором система B1H использовалась для определения специфичности связывания ДНК регулятора транскрипции гена Mycobacterium Tuberculosis . ^{[ 9 ]} Система B1H также использовалась для идентификации важного элемента оборота Escherichia coli. ^{[ 10 ]}

Внешние ссылки

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и Булык М (2005). «Обнаружение регуляторных элементов ДНК у бактерий» . Природная биотехнология . 23 (8): 942–944. дои : 10.1038/nbt0805-942 . ПМК 2720157 . ПМИД 16082362 .
^ Мессина Д.Н., Гласскок Дж., Гиш В., Ловетт М. (2004). «Анализ генов транскрипционных факторов человека на основе ORFeome и создание микроматрицы для исследования их экспрессии» . Геномные исследования . 14 (2004): 2041–2047. дои : 10.1101/гр.2584104 . ISSN 1088-9051 . ПМК 528918 . ПМИД 15489324 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж Мэн X, Вулф С.А. (2006). «Идентификация последовательностей ДНК, распознаваемых фактором транскрипции, с использованием бактериальной одногибридной системы». Протоколы природы . 1 (1): 30–45. дои : 10.1038/нпрот.2006.6 . ПМИД 17406209 . S2CID 52855158 .
^ Йонг Дж. К., Рамм Э. Л., Пабо Ко (2000). «Бактериальная двухгибридная система селекции для изучения белок-ДНК и белок-белковых взаимодействий» . ПНАС . 97 (13): 7382–7387. Бибкод : 2000PNAS...97.7382J . дои : 10.1073/pnas.110149297 . ПМК 16554 . ПМИД 10852947 .
^ Уилсон Т.Э., Фарнер Т.Дж., Джонстон М., Милбрант Дж. (1991). «Идентификация сайта связывания ДНК для NGFI-B путем генетической селекции у дрожжей». Наука . 252 (5010): 1296–1300. дои : 10.1126/science.1925541 . ПМИД 1925541 .
^ Нойес М.Б., Кристенсен Р.Г., Вакабаяши А., Стормо Г.Д., Бродский М.Х., Вулф С.А. (2006). «Анализ особенностей гомеодомена позволяет прогнозировать предпочтительные места узнавания для всей семьи» . Клетка . 133 (2008): 1277–1289. дои : 10.1016/j.cell.2008.05.023 . ПМЦ 2478728 . ПМИД 18585360 .
^ Дурай С., Босли А., Абуленсия А.Б., Чандрасегаран С., Остермейер М. (2006). «Бактериальная одногибридная система селекции для исследования взаимодействий цинкового пальца с ДНК». Комбинаторная химия и высокопроизводительный скрининг . 9 (2006): 301–311. дои : 10.2174/138620706776843147 . ПМИД 16724921 .
^ Нойес М.Б., Мэн X, Вакабаяши А., Синха С., Бродский М.Х., Вулф С.А. (2008). «Систематическая характеристика факторов, регулирующих сегментацию дрозофилы посредством бактериальной одногибридной системы» . Исследования нуклеиновых кислот . 36 (8): 2547–2560. дои : 10.1093/нар/gkn048 . ПМК 2377422 . ПМИД 18332042 .
^ Го М, Фэн Х, Чжан Дж, Ван В, Ван Дж, Ли Ю, Гао С, Чэнь Х, Фэн Ю, Хэ ЗГ (2009). «Изучение путей регуляции транскрипции с помощью новой бактериальной одногибридной репортерной системы» . Геномные исследования . 19 (7): 1301–8. дои : 10.1101/гр.086595.108 . ПМК 2704442 . ПМИД 19228590 .
^ Обрист М., Нарберхаус Ф (2005). «Идентификация оборотного элемента в регионе 2.1 Escherichia coli 32 с помощью бактериального одногибридного подхода» . Журнал бактериологии . 187 (11): 3807–3813. дои : 10.1128/JB.187.11.3807-3813.2005 . ПМК 1112070 . ПМИД 15901705 .

[Alpha-1] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и Булык М (2005). «Обнаружение регуляторных элементов ДНК у бактерий» . Природная биотехнология . 23 (8): 942–944. дои : 10.1038/nbt0805-942 . ПМК 2720157 . ПМИД 16082362 .

[2] Мессина Д.Н., Гласскок Дж., Гиш В., Ловетт М. (2004). «Анализ генов транскрипционных факторов человека на основе ORFeome и создание микроматрицы для исследования их экспрессии» . Геномные исследования . 14 (2004): 2041–2047. дои : 10.1101/гр.2584104 . ISSN 1088-9051 . ПМК 528918 . ПМИД 15489324 .

[Beta-3] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж Мэн X, Вулф С.А. (2006). «Идентификация последовательностей ДНК, распознаваемых фактором транскрипции, с использованием бактериальной одногибридной системы». Протоколы природы . 1 (1): 30–45. дои : 10.1038/нпрот.2006.6 . ПМИД 17406209 . S2CID 52855158 .

[4] Йонг Дж. К., Рамм Э. Л., Пабо Ко (2000). «Бактериальная двухгибридная система селекции для изучения белок-ДНК и белок-белковых взаимодействий» . ПНАС . 97 (13): 7382–7387. Бибкод : 2000PNAS...97.7382J . дои : 10.1073/pnas.110149297 . ПМК 16554 . ПМИД 10852947 .

[5] Уилсон Т.Э., Фарнер Т.Дж., Джонстон М., Милбрант Дж. (1991). «Идентификация сайта связывания ДНК для NGFI-B путем генетической селекции у дрожжей». Наука . 252 (5010): 1296–1300. дои : 10.1126/science.1925541 . ПМИД 1925541 .

[6] Нойес М.Б., Кристенсен Р.Г., Вакабаяши А., Стормо Г.Д., Бродский М.Х., Вулф С.А. (2006). «Анализ особенностей гомеодомена позволяет прогнозировать предпочтительные места узнавания для всей семьи» . Клетка . 133 (2008): 1277–1289. дои : 10.1016/j.cell.2008.05.023 . ПМЦ 2478728 . ПМИД 18585360 .

[7] Дурай С., Босли А., Абуленсия А.Б., Чандрасегаран С., Остермейер М. (2006). «Бактериальная одногибридная система селекции для исследования взаимодействий цинкового пальца с ДНК». Комбинаторная химия и высокопроизводительный скрининг . 9 (2006): 301–311. дои : 10.2174/138620706776843147 . ПМИД 16724921 .

[8] Нойес М.Б., Мэн X, Вакабаяши А., Синха С., Бродский М.Х., Вулф С.А. (2008). «Систематическая характеристика факторов, регулирующих сегментацию дрозофилы посредством бактериальной одногибридной системы» . Исследования нуклеиновых кислот . 36 (8): 2547–2560. дои : 10.1093/нар/gkn048 . ПМК 2377422 . ПМИД 18332042 .

[9] Го М, Фэн Х, Чжан Дж, Ван В, Ван Дж, Ли Ю, Гао С, Чэнь Х, Фэн Ю, Хэ ЗГ (2009). «Изучение путей регуляции транскрипции с помощью новой бактериальной одногибридной репортерной системы» . Геномные исследования . 19 (7): 1301–8. дои : 10.1101/гр.086595.108 . ПМК 2704442 . ПМИД 19228590 .

[10] Обрист М., Нарберхаус Ф (2005). «Идентификация оборотного элемента в регионе 2.1 Escherichia coli 32 с помощью бактериального одногибридного подхода» . Журнал бактериологии . 187 (11): 3807–3813. дои : 10.1128/JB.187.11.3807-3813.2005 . ПМК 1112070 . ПМИД 15901705 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]