CRISPR-Дисплей

CRISPR-Display ( CRISP-Disp ) — это модификация системы CRISPR/Cas9 (Кластерные короткие палиндромные повторы с регулярными интервалами) для редактирования генома. Система CRISPR/Cas9 использует последовательность короткой направляющей РНК (sgRNA), чтобы направить Streptococcus pyogenes нуклеазу Cas9 , действующую как программируемый ДНК-связывающий белок, на расщепление ДНК в интересующем сайте. ^{[ 1 ]}^{[ 2 ]}

CRISPR-Display, напротив, использует дефицитный по нуклеазе Cas9 (dCas9) и сконструированную sgRNA с доменами аптамерной дополнительной РНК размером от 100 п.н. до 5 т.п.н., за пределами нормальной комплементарной нацеливающей последовательности. ^{[ 3 ]} Дополнительные домены РНК могут представлять собой функциональные домены, такие как длинные некодирующие РНК ( днРНК ), белок-связывающие мотивы или эпитопные метки для иммунохимии. Это позволяет исследовать функциональность определенных днРНК и направлять комплексы рибонуклеопротеина (РНП) на геномные локусы.

CRISPR-Display был впервые опубликован в журнале Nature Methods в июле 2015 года и разработан Дэвидом М. Шехнером, Эзги Хацисулейманом, Скоттом Т. Янгером и Джоном Ринном из Гарвардского университета и Массачусетского технологического института (MIT), США.

Фон

Система CRISPR/Cas9 основана на адаптивной иммунной системе прокариотических организмов, и ее использование для редактирования генома было впервые предложено и разработано в сотрудничестве Дженнифер Дудна ( Калифорнийский университет, Беркли ) и Эммануэль Шарпантье ( Институт биологии инфекций Макса Планка , Германия). ^{[ 1 ]} Этот метод и его применение для редактирования человеческих клеток были опубликованы в журнале Science 17 августа 2012 года. В январе 2013 года лаборатория Фэн Чжана в Институте Броуда Массачусетского технологического института опубликовала в журнале Science еще один метод, дополнительно оптимизировав структуру и экспрессию sgRNA для использование в клетках млекопитающих. ^{[ 2 ]} К началу 2014 года было опубликовано почти 2500 исследований, в названии которых упоминается CRISPR.

Некодирующие РНК (нкРНК) представляют собой транскрипты РНК, которые не транслируются в белковый продукт, а вместо этого выполняют свою функцию молекул РНК. Они участвуют в ряде процессов, таких как посттранскрипционная регуляция экспрессии генов, геномный импринтинг и регулирование состояния хроматина и, следовательно, экспрессии данного локуса. Было обнаружено множество нкРНК, но во многих случаях их функция до сих пор не изучена из-за технических проблем. На функцию нкРНК часто не влияют точечные мутации и преждевременные стоп-кодоны. Считается, что нкРНК также регулируют экспрессию генов, поэтому в исследованиях делеции трудно отличить эффекты потери нкРНК от эффектов неправильной регуляции генов из-за делеции. Исследования нкРНК также не имели достаточной производительности, необходимой для определения функциональности, основанной на РНК. Чтобы решить эти проблемы, лаборатория Ринна разработала подход синтетической биологии, используя систему CRISPR/Cas9, где Cas9 действует как канал, для нацеливания модулей нкРНК в эктопические места генома и исследуя влияние нкРНК на репортерные гены и другие геномные особенности. на этом сайте.

Разработка метода

CRISPR-Disp модифицирует технологию CRISPR/Cas9, используя каталитически неактивный, то есть дефицитный по нуклеазе, мутант Cas9 (dCas9) и изменяя РНК, используемую для нацеливания Cas9 на геномное местоположение.

Поскольку sgRNA обычно экспрессируются РНК-полимеразой III , что ограничивает длину встраиваемого домена РНК, CRISPR-Display включает РНК-полимеразу II, чтобы обеспечить экспрессию более длинных транскриптов (~ 80–250 нуклеотидов) и преодолеть это ограничение. Таким образом, CRISPR-Display может добавлять более крупные домены РНК, такие как природные домены и домены днРНК, не влияя на локализацию dCas9.

sgRNA сконструирована с аптамерным дополнительным доменом РНК в последовательности, находящейся за пределами нацеливающей последовательности. При разработке методики были использованы пять модельных кофакторов с различными конструкциями топологии: TOP1-4 и INT с дополнительным доменом (домен P4-P6) в разных положениях, включая 5'- и 3'-конец и внутри sgRNA. Каждый домен содержал «стебель-петлю», которую можно распознать белком оболочки бактериофага PP7. Комплекс доставлялся в клетки млекопитающих (клетки HEK293FT) с помощью лентивирусного вектора .

Чтобы гарантировать, что прикрепленный модуль РНК сохраняет как нацеливающую функциональность, так и результирующий комплекс, управляющий активацией транскрипции в конкретном интересующем сайте, временную экспрессию репортерного гена люциферазы измеряли два варианта такого анализа активатора транскрипции и флуоресцентного белка. Были проведены ; непосредственно с dCas9, слитым с активатором/репрессором транскрипции (VP64, фактор, который, как известно, усиливает экспрессию генов) (прямая активация) или опосредованно, когда активатор транскрипции слит с РНК-связывающим белковым модулем на sgRNA (мостиковая активация) . Активация репортерного гена посредством прямой активации подразумевает, что вариант sgRNA эффективно связывается и нацеливается на dCas9. Во всех пяти топологиях наблюдалась прямая активация, за исключением TOP3 и TOP4, в которых наблюдалась пониженная активность. Мостиковая активация указывает на то, что слитый дополнительный домен РНК не поврежден в зрелых комплексах dCas9. Мостовая активация наблюдалась с TOP1, TOP3 и INT. Результаты были обобщены на эндогенных локусах путем нацеливания минимальной sgRNA и выборочных расширенных топологий (TOP1 и INT) на человеческие промоторы ASCL1, IL1RN, NTF3 и TTN. Прямая и мостиковая активация наблюдалась с помощью qRT-PCR для каждой конструкции, что доказывает, что CRISP-Disp позволяет размещать большие домены РНК в геномных локусах.

Влияние размера внутренней (стебель-петли) вставки на комплекс dCas9 оценивали с использованием INT-подобных конструкций с кассетами стебельных петель PP7 с диапазоном размеров от 25 нт до 247 нт. Каждая конструкция вызывала значительную активацию в репортерных анализах, что означает, что размер внутренней вставки не влияет на функцию комплекса dCas9. Аналогичным образом, эффект внутренней вставки последовательности также определялся с помощью набора уникальных вариантов sgRNA, отображающих кассеты из 25 случайных нуклеотидов. Репортерные анализы и RIP-Seq подтвердили, что последовательность не влияет на эффективность комплекса.

Полезность CRISP-Disp исследовалась с использованием множества функциональных доменов РНК, таких как природные мотивы связывания белков, искусственные аптамеры и небольшие молекулы различного размера. Хотя все комплексы были функциональными и жизнеспособными и успешно размещали домены РНК в эндогенных локусах, эффективность менялась в зависимости от длины и уровня экспрессии. Это говорит о том, что оптимизация структуры и последовательности может оказаться важной перед разработкой конструкции.

Чтобы определить, можно ли использовать искусственные каркасы днРНК с CRISPR-Display, комплексы dCas9 собирали с искусственной РНК размером, сравнимым с размерами днРНК. Конструкции были расширены до размера ~650 нт за счет дополнительного домена P4-P6 со шпильками, которые могут распознаваться другим белком фаговой оболочки, MS2. Эти конструкции топологии были названы двойными TOP0-2 с двумя доменами либо вместе на 5'- или 3'-конце, либо отдельно на каждом конце. Анализы временных репортеров с последующим подтверждением с помощью иммунопреципитационного секвенирования РНК (RIP-qPCR) показали, что все три конструкции сохранили оба домена в комплексе.

Это также было протестировано с природными доменами днРНК путем создания управляемых Pol II конструкций TOP1 и INT, слитых с доменами днРНК человека. Используемые днРНК имели длину ~90–4800 нт и включали NoRC-связывающую пРНК, три РНК, транскрибируемые энхансером (еРНК): FALEC, TRERNA1 и нкРНК-а3), Xist A-повтор (RepA) и транскрипционный фрагмент длиной 4799 нт. активатор ХОТТИП . Хотя все конструкции показали значительную прямую активацию, она уменьшалась с увеличением длины днРНК-мгРНК. Эти домены lncRNA могли регулировать репортеры независимо от dCas9 с помощью pRNA и RepA, подавляющих экспрессию репортера GLuc (репрессоры), и TRERNA1, ncRNA-a3 и индуцирующей активацию HOTTIP (активаторы), но были должным образом нацелены на интересующую эктопическую область с помощью CRISP. -Система отображения. ^{[ 3 ]}

Таким образом, CRISP-Disp позволяет контролировать экспрессию генов с использованием как искусственных каркасов, так и естественных доменов днРНК.

Приложения

CRISPR-Display позволяет проводить ранее недоступные исследования функциональности lncRNA, искусственной функционализации ncRNA, рекрутирования эндогенных и сконструированных белков в геномные локусы, а также мечения аффинности локусов для визуализации клеток.

локализация домена днРНК

CRISPR-Display позволяет целенаправленно локализовать природные днРНК в эктопических участках для исследования их функции. Воздействие природных днРНК на различные эктопические локусы ДНК может помочь показать влияние днРНК на экспрессию генов и состояние хроматина, а также помочь проанализировать механизм таких эффектов. Один из основных нерешенных вопросов в изучении днРНК заключается в том, обусловлено ли влияние на состояние хроматина или экспрессию генов, прилегающих к локусу днРНК, функциональными, специфичными для последовательности механизмами самой днРНК или просто актом транскрипции днРНК. ^{[ 4 ]}^{[ 5 ]} Локализация днРНК в эктопических участках с помощью CRISPR-Display может помочь отделить функцию самой РНК от эффектов транскрипции таких видов РНК. До появления CRISPR-Display такие исследования были сложными из-за низкой производительности и неспособности отличить функцию днРНК от других мешающих факторов, таких как загадочно кодируемые пептиды или функциональные элементы ДНК.

Искусственная функционализация нкРНК

CRISPR-Display также позволяет целенаправленно использовать широкий спектр искусственных РНК с определенной функциональностью, таких как РНК для рекрутирования эндогенных РНК-связывающих белков, аффинного мечения антител и рекрутирования меченых слитых белков.

Аффинитивная маркировка для визуализации живых клеток

Одним из примеров искусственной функционализации нкРНК является включение доменов РНК, распознаваемых специфическими антителами к sgRNA. CRISPR-Display может нацеливать sgRNA с определенной эпитопной последовательностью на различные локусы, а антитела с флуоресцентной меткой можно использовать для изображения локуса, показывая его локализацию в ядре и возможные взаимодействия с другими мечеными белками или геномными локусами.

Привлечение эндогенных или сконструированных РНК-связывающих белков для регуляции генов.

Эндогенные белки, которые, как известно, связывают специфический мотив РНК, могут быть рекрутированы в эктопические места генома путем включения мотива РНК в sgRNA. CRISPR-Display также может рекрутировать слитые белки, созданные для связывания определенных последовательностей РНК. Привлечение этих белков может позволить изучить влияние конкретных белков и белковых комплексов на регуляцию генов и состояние хроматина, а также специфическую регуляцию определенных генов для исследования функции генов.

Мультиплексные функциональные исследования

Благодаря модульности sgRNA в каждой клетке могут одновременно экспрессироваться несколько различных sgRNA с разными функциональными модулями. Различные модули РНК затем могут работать одновременно и независимо, позволяя, например, регулировать одно место генома, одновременно визуализируя эффекты регуляции в другом месте.

Возможные применения CRISPR-Display будут продолжать расширяться по мере дальнейшего развития и понимания функционализации нкРНК. Вполне разумно полагать, что CRISPR-Display однажды сможет создать сложные синтетические биологические системы с четкой временной экспрессией sgRNA, а также сети и схемы регуляции генов путем нацеливания на регуляторные белки.

Преимущества

Может легко разместить большой груз РНК (до ~ 4,8 КБ, возможно, даже больше) внутри ядра sgRNA. Таким образом, с dCas9 можно использовать структурированные домены РНК, природные длинные днРНК, искусственные модули РНК и пулы случайных последовательностей.
Комплексообразование sgRNA-dCas9 не ограничивается составом последовательностей груза РНК, но, по-видимому, не зависит от используемых модулей РНК.
CRISPR-Display — это модульный метод, который позволяет одновременно выполнять различные функции в разных локусах одной и той же клетки. Использование единой конструкции с ортогональными РНК-связывающими белками, где каждый белок слит с уникальным функциональным доменом и нацелен на sgRNA, содержащую родственный ему мотив РНК. (мультиплексирование) (уже включено в приложения)
Модули РНК можно добавлять в разные места последовательности sgRNA (внутри или на 5'- или 3'-концах), поэтому расположение модуля РНК можно оптимизировать или обеспечить наилучшее функционирование.
Позволяет создавать комплексы Cas9 с белок-связывающими кассетами, искусственными аптамерами, пулами случайных последовательностей, а также природными днРНК.

Ограничения

CRISPR-Display в настоящее время ограничен количеством доступных функциональных мотивов РНК и функций РНК-связывающих белков. По мере открытия и разработки большего количества таких мотивов и белков могут стать возможными дальнейшие применения CRISPR-Display.
Образование комплекса dCas9 уменьшается с увеличением длины sgRNA-lncRNA. Однако количественные выходы интактных доменов днРНК восстанавливаются по сравнению с соответствующими sgRNA. Следовательно, целостность конструкции может зависеть от таких факторов, как длина и структура РНК.
Разработка высокоэффективной конструкции CRISPR-Display может потребовать некоторой оптимизации структуры или последовательности, что может привести к различной эффективности конструкции.

Ссылки

^ Перейти обратно: ^а ^б Джинек, Мартин; Чилинский, Кшиштоф; Фонфара, Инес; Хауэр, Майкл; Дудна, Дженнифер А.; Шарпантье, Эммануэль (17 августа 2012 г.). «Программируемая ДНК-эндонуклеаза, управляемая двойной РНК, в адаптивном бактериальном иммунитете» . Наука . 337 (6096): 816–821. Бибкод : 2012Sci...337..816J . дои : 10.1126/science.1225829 . ISSN 1095-9203 . ПМК 6286148 . ПМИД 22745249 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Конг, Ле; Ран, Ф. Энн; Кокс, Дэвид; Линь, Шуайлян; Барретто, Роберт; Хабиб, Наоми; Сюй, Патрик Д.; У, Сюэбин; Цзян, Вэньян (15 февраля 2013 г.). «Мультиплексная геномная инженерия с использованием систем CRISPR/Cas» . Наука . 339 (6121): 819–823. Бибкод : 2013Sci...339..819C . дои : 10.1126/science.1231143 . ISSN 1095-9203 . ПМЦ 3795411 . ПМИД 23287718 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Шехнер, Дэвид М.; Хаджисулейман, Эзги; Младший, Скотт Т.; Ринн, Джон Л. (01 июля 2015 г.). «Мультиплексное локус-специфическое нацеливание длинных РНК с помощью CRISPR-Display» . Природные методы . 12 (7): 664–670. дои : 10.1038/nmeth.3433 . ISSN 1548-7105 . ПМЦ 4821475 . ПМИД 26030444 .
^ Перес-Пинера, Пабло; Джонс, Мэтью Ф.; Лал, Ашиш; Лу, Тимоти К. (16 июля 2015 г.). «Выведение некодирующей РНК на дисплей с помощью CRISPR» . Молекулярная клетка . 59 (2): 146–148. doi : 10.1016/j.molcel.2015.07.002 . ISSN 1097-4164 . ПМК 6314022 . ПМИД 26186289 .
^ Меле, Марта; Ринн, Джон Л. (2 июня 2016 г.). « Кошачья колыбель» трехмерного генома посредством транскрипции LncRNA» . Молекулярная клетка . 62 (5): 657–664. doi : 10.1016/j.molcel.2016.05.011 . ISSN 1097-4164 . ПМИД 27259198 .

[:0-1] Перейти обратно: ^а ^б Джинек, Мартин; Чилинский, Кшиштоф; Фонфара, Инес; Хауэр, Майкл; Дудна, Дженнифер А.; Шарпантье, Эммануэль (17 августа 2012 г.). «Программируемая ДНК-эндонуклеаза, управляемая двойной РНК, в адаптивном бактериальном иммунитете» . Наука . 337 (6096): 816–821. Бибкод : 2012Sci...337..816J . дои : 10.1126/science.1225829 . ISSN 1095-9203 . ПМК 6286148 . ПМИД 22745249 .

[:1-2] Перейти обратно: ^а ^б Конг, Ле; Ран, Ф. Энн; Кокс, Дэвид; Линь, Шуайлян; Барретто, Роберт; Хабиб, Наоми; Сюй, Патрик Д.; У, Сюэбин; Цзян, Вэньян (15 февраля 2013 г.). «Мультиплексная геномная инженерия с использованием систем CRISPR/Cas» . Наука . 339 (6121): 819–823. Бибкод : 2013Sci...339..819C . дои : 10.1126/science.1231143 . ISSN 1095-9203 . ПМЦ 3795411 . ПМИД 23287718 .

[:2-3] Перейти обратно: ^а ^б Шехнер, Дэвид М.; Хаджисулейман, Эзги; Младший, Скотт Т.; Ринн, Джон Л. (01 июля 2015 г.). «Мультиплексное локус-специфическое нацеливание длинных РНК с помощью CRISPR-Display» . Природные методы . 12 (7): 664–670. дои : 10.1038/nmeth.3433 . ISSN 1548-7105 . ПМЦ 4821475 . ПМИД 26030444 .

[4] Перес-Пинера, Пабло; Джонс, Мэтью Ф.; Лал, Ашиш; Лу, Тимоти К. (16 июля 2015 г.). «Выведение некодирующей РНК на дисплей с помощью CRISPR» . Молекулярная клетка . 59 (2): 146–148. doi : 10.1016/j.molcel.2015.07.002 . ISSN 1097-4164 . ПМК 6314022 . ПМИД 26186289 .

[5] Меле, Марта; Ринн, Джон Л. (2 июня 2016 г.). « Кошачья колыбель» трехмерного генома посредством транскрипции LncRNA» . Молекулярная клетка . 62 (5): 657–664. doi : 10.1016/j.molcel.2016.05.011 . ISSN 1097-4164 . ПМИД 27259198 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]