Магнитное секвенирование одной молекулы
Магнитное секвенирование одиночных молекул, — это метод секвенирования находящийся в стадии разработки. Шпилька ДНК , содержащая интересующую последовательность, прикреплена между магнитной бусиной и стеклянной поверхностью. Магнитное поле применяется для растягивания шпильки на отдельные пряди, и шпилька снова сгибается после уменьшения магнитного поля. Длину шпильки можно определить путем прямого изображения дифракционных колец магнитных шариков с помощью простого микроскопа. Последовательности ДНК определяют путем измерения изменений длины шпильки после успешной гибридизации комплементарных нуклеотидов. [1]
Секвенирование одиночных молекул против секвенирования следующего поколения
[ редактировать ]С разработкой различных платформ для секвенирования нового поколения произошло существенное снижение затрат и увеличение производительности секвенирования ДНК. Однако большинство технологий секвенирования основаны на клональной амплификации молекулы ДНК на основе ПЦР , чтобы довести сигнал до обнаружимого диапазона. [2] Секвенирование амплифицированных кластеров или объемное секвенирование в таком случае предполагает проблему фазировки, зависящей от длины считывания. Во время каждого цикла не все молекулы в основной массе успешно включают дополнительный нуклеотид. При увеличении цикла секвенирования сигнал отстающих молекул в конечном итоге будет подавлять истинный сигнал. Проблема фазировки является основным ограничением длины считывания технологий секвенирования следующего поколения. Поэтому существует повышенный интерес к разработке технологий секвенирования одиночных молекул, не требующих амплификации. Это не только сокращает время подготовки библиотек секвенирования, но и потенциально позволяет достичь гораздо большей длины считывания, поскольку отстающие молекулы с неудачными расширениями можно игнорировать или рассматривать отдельно. Ранее известные технологии секвенирования одиночных молекул включают секвенирование Nanopore (Oxford Nanopore), [3] Секвенирование SMRT ( Pacific Biosciences ), [4] и секвенирование одиночных молекул Heliscope ( Helicos Biosciences ). [5]
Магнитное обнаружение олигонуклеотидов, гибридизованных со шпилькой ДНК
[ редактировать ]
Генерация шпильки ДНК
[ редактировать ]Интересующую молекулу ДНК необходимо включить в шпильку и прикрепить к магнитной бусине на одном конце и к неподвижной стеклянной поверхности на другом конце. Шпилька прикрепляется к поверхности стекла посредством связи дигоксигенин -антидигоксигенин. [1] Магнитный шарик прикрепляется к противоположному концу посредством взаимодействия биотина и стрептавидина . [1] Подобную установку шпильки ДНК можно сделать двумя способами:
- 1) В случае двухцепочечных молекул ДНК (для полногеномного секвенирования или целевого секвенирования) фрагмент ДНК лигируется с петлей ДНК на одном конце и вилочной структурой ДНК, меченной биотином и дигоксигенином на двух концах. [1]
- 2) Для RNA-seq мРНК может быть поймана на шарике, покрытом поли-Т, где обратной транскрипции на шарике выполняется реакция для создания шпильки кДНК . [1]
Измерение длины шпильки
[ редактировать ]Электромагниты размещаются над предметным стеклом. [6] а инвертированный микроскоп . внизу — [7] Изображение снимается с помощью ПЗС-камеры и передается на компьютер, где определяется трехмерное положение магнитных шариков. Положение бусинки в горизонтальной плоскости предметного стекла, x и y, определяется путем корреляции изображений бусинок в реальном времени. [8] Вертикальная длина шпильки, измеряемая по вертикальному положению прикрепленной магнитной бусины, измеряется диаметром дифракционного кольца бусины, который увеличивается с расстоянием. [7]
Открытие и закрытие шпильки ДНК
[ редактировать ]Для расстегивания шпильки ДНК применяется постоянная магнитная сила, а уменьшение силы позволяет повторно застегнуть шпильку. [9] Перед выполнением последующих приложений выполняется несколько циклов распаковки и повторной архивации. Хотя магнитная сила, необходимая для расстегивания и повторного застегивания, может варьироваться в зависимости от последовательности ДНК и длины шпильки, их абсолютные значения не имеют решающего значения, если они постоянны в ходе секвенирования. [1]
Обнаружение событий гибридизации
[ редактировать ]Когда шпилька ДНК расстегивается на одноцепочечную, олигонуклеотиды, комплементарные последовательности шпильки, могут гибридизоваться. В ходе процесса перезастегивания связанные олигонуклеотиды вызывают временную блокировку. [1] Измерение длины шпильки во времени позволяет определить точное положение гибридизации, а также наличие несоответствий между олигонуклеотидом и шпилькой. [1]
Приложения для определения длины шпильки при секвенировании
[ редактировать ]Секвенирование путем гибридизации
[ редактировать ]
Гибридизация — это один из способов определения последовательности цепи ДНК по изменению длины шпильки. Когда зонд гибридизуется с открытой шпилькой, полное рефолдинг шпильки останавливается, и можно сделать вывод о положении гибридизированного зонда. Таким образом, последовательность интересующего фрагмента ДНК можно определить по перекрыванию положений наборов зондов, которым разрешено гибридизоваться один за другим. [10]
Генерация 8-нуклеотидной последовательности
[ редактировать ]Во-первых, фрагмент ДНК может быть преобразован в новую последовательность, в которой каждый исходный нуклеотид кодируется определенной последовательностью из 8 нуклеотидов (A8, T8, G8 и C8). [11] а затем лигировали на шпильку.
Гибридизация олигонуклеотидов A8, T8, C8, G8
[ редактировать ]После приложения магнитной силы в расстегнутом состоянии шпильки небольшое количество различающих нуклеотидов может гибридизоваться с новыми отдельными комплементарными последовательностями на шпильке, что может временно блокировать повторное сворачивание шпильки.
Позиции на карте
[ редактировать ]Идентификацию положений блокировки шпильки, возникающих в результате гибридизации дискриминирующих нуклеотидов, можно наблюдать как паузы во временном ходе измерения расстояния шпильки. Полную последовательность можно восстановить по перекрывающимся фрагментам.
Секвенирование путем лигирования
[ редактировать ]
Еще одним применением магнитного секвенирования является использование расстояния между концами шпильки для обнаружения последовательного лигирования олигонуклеотидов. [12] Первым этапом секвенирования путем лигирования является использование праймера для удлинения фрагмента ДНК. Сначала пытаются удлинить фрагмент, начинающийся с аденина, который можно лигировать только в том случае, если следующим нуклеотидом на противоположной цепи является тимин. Затем поочередно пробуют фрагменты, начиная с цитозина, гуанина и тимина, и цикл повторяется. Магнитное поле высвобождается после каждого лигирования, а затем измеряется длина удлиненного праймера. При лигировании праймер удлиняется на семь оснований, что приводит к заметному увеличению расстояния между концами шпильки. За расщеплением РНКазы в положении 2 следует лигирование для подготовки следующего цикла лигирования, так что следующее лигирование располагается непосредственно перед предыдущим. [10]
библиотека учебников 7nt
[ редактировать ]Библиотека праймеров из 7 нуклеотидов, 5'-NNNNNNrX-3', используется для лигирования короткого вырожденного олигонуклеотидного фрагментина, в котором N представляет собой любой из четырех дезоксирибонуклеотидов , а Nr представляет собой любой из четырех рибонуклеотидов , X представляет собой тестируемое основание ( А,Г,В,Т). Тестируется лигирование праймерной цепи каждого из четырех тестируемых оснований в циклах открытия и закрытия шпильки. [1]
перевязка
[ редактировать ]7-нуклеотидный праймер лигируется в открытом состоянии шпильки, что блокирует перезастегивание последних семи нуклеотидов и увеличивает расстояние между поверхностью и магнитным шариком на ~5 нм. [1] Если перевязка не удалась, изменения длины шпильки не наблюдается.
РНКаза
[ редактировать ]Расщепление РНКазой последних шести нуклеотидов является следующим шагом после лигирования, в конечном итоге удлиняющим цепь праймера на одно основание. Такое расщепление позволяет повторно застегнуть 6 нуклеотидов шпильки, о чем свидетельствует уменьшение длины шпильки на ~4 нм. [1] Следовательно, на включение комплементарного нуклеотида указывает увеличение на 7 нуклеотидов (+5 нм) с последующим уменьшением на 6 нуклеотидов (-4 нм). [1]
Киназа
[ редактировать ]После расщепления РНКазой последних шести нуклеотидов следующим шагом является фосфорилирование 5'-конца с помощью киназы . Затем следующий цикл перевязки можно повторить.
Преимущества магнитного метода в секвенировании одиночных молекул
[ редактировать ]Характер обнаруженного сигнала
[ редактировать ]Многие из конкурентных методов секвенирования одиночных молекул основаны на включении флуоресцентно меченных нуклеотидов. [4] [5] При секвенировании нового поколения можно легко обнаружить сигнал флуоресценции кластеров. Однако когда та же концепция применяется к секвенированию одиночных молекул, наибольшая сложность возникает из-за высокого уровня ошибок. Поскольку обнаружить одиночно меченые молекулы трудно, эти платформы страдают от низкого отношения сигнал/шум, что часто приводит к неправильному обнаружению или необнаружению флуоресцентных сигналов. [13] В случае магнитного секвенирования измеряемым сигналом является изменение расстояния между двумя концами шпильки. Такой сигнал можно легко обнаружить с помощью стандартных камер. Таким образом, сигналы легче обнаружить даже без использования дорогостоящих устройств формирования изображения.
Ослабление экспериментальных ограничений для дискриминации отдельных нуклеотидов
[ редактировать ]Помимо характера обнаруживаемого сигнала, другие реализации этой платформы обеспечивают еще более высокое соотношение сигнал/шум. В случае магнитного секвенирования путем гибридизации используется набор перекрывающихся плиток, так что последовательность каждого нуклеотида определяется гибридизацией 8-мера. [1] Таким образом, прибору требуется чувствительность только для обнаружения изменения ~ 6 нм (длина 8 нуклеотидов). Аналогично, для секвенирования с помощью циклов лигирования успешное включение характеризуется увеличением длины шпильки на ~5 нм (связывание 7-мера) с последующим уменьшением на ~4 нм (расщепление 6-мера РНКазой). [1] В этом случае уменьшение длины на втором этапе дает дополнительное подтверждение полученному сигналу.
Технические соображения
[ редактировать ]Разрешение
[ редактировать ]При использовании существующих методов инструментальная погрешность измерения длины шпильки составляет 1–1,5 нм. [1] Длина пары оснований, или двух удлиненных одноцепочечных нуклеотидов, составляет примерно 0,85 нм. [1] Следовательно, разрешение системы составляет несколько нуклеотидов. Источники шума возникают из-за зависящего от длины броуновского движения шарика, закрепленного удлиненной шпилькой, статистической ошибки в определении положения шарика и медленных механических дрейфов. [1] Однако, как упоминалось ранее, такого разрешения достаточно для текущего метода секвенирования, поскольку измеряются изменения >4 нм.
Пропускная способность
[ редактировать ]Благодаря использованию магнитных ловушек [6] Постоянная магнитная сила может быть приложена к миллионам магнитных шариков ДНК, связанных шпильками, параллельно. Магнитную силу можно легко регулировать, изменяя расстояние между ловушкой и магнитными шариками. Количество ридов, которые можно контролировать одновременно, что определяет пропускную способность считывания этой платформы, ограничено размером бусинок, длиной привязанной шпильки ДНК и пределом оптического разрешения. [1] В настоящее время плотность 750 К/мм. 2 (по сравнению с Illumina HiSeq 2000) [14] может быть достигнуто. [1]
Длина чтения
[ редактировать ]Как уже говорилось выше, шум, обусловленный броуновскими колебаниями шарика, увеличивается с длиной. Еще предстоит провести надежные тесты секвенирования для определения максимальной длины чтения этой системы. Однако лигирование 7-мера в середине шпильки длиной 1241 нуклеотид было успешно обнаружено, что позволяет предположить, что существующей системы достаточно для секвенирования до ~ 500 п.о. [1]
Дополнительные ограничения
[ редактировать ]Скорость секвенирования или визуализации зависит от скорости механического движения магнитных шариков, которая ограничивается силой сопротивления. [1] В настоящее время можно измерить 10 циклов открытия-закрытия шпильки в секунду. [1] Дополнительные осложнения включают существование вторичной шпилечной структуры в интересующей ДНК. В таком случае лигируемая петля ДНК должна быть сконструирована таким образом, чтобы ее закрытие было более предпочтительным, чем закрытие эндогенной петли в интересующей ДНК. [1]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я дж к л м н тот п д р с т в v В Дин Ф., Маносас М., Спиринг М.М., Бенкович С.Дж., Бенсимон Д., Аллеманд Дж.Ф., Крокетт В. (март 2012 г.). «Механическая идентификация и секвенирование одиночных молекул» . Нат. Методы . 9 (4): 367–72. дои : 10.1038/nmeth.1925 . ПМК 3528176 . ПМИД 22406857 .
- ^ Шендуре Дж., Джи Х (октябрь 2008 г.). «Секвенирование ДНК нового поколения». Нат. Биотехнология . 26 (10): 1135–45. дои : 10.1038/nbt1486 . ПМИД 18846087 . S2CID 6384349 .
- ^ Брэнтон Д., Димер Д.В., Марциали А., Бэйли Х., Беннер С.А., Батлер Т. и др. (октябрь 2008 г.). «Потенциал и проблемы секвенирования нанопор» . Нат. Биотехнология . 26 (10): 1146–53. дои : 10.1038/nbt.1495 . ПМЦ 2683588 . ПМИД 18846088 .
- ^ Jump up to: а б Ид Дж., Фер А., Грей Дж., Луонг К., Лайл Дж., Отто Дж. и др. (январь 2009 г.). «Секвенирование ДНК в реальном времени из отдельных молекул полимеразы». Наука . 323 (5910): 133–8. Бибкод : 2009Sci...323..133E . дои : 10.1126/science.1162986 . ПМИД 19023044 . S2CID 54488479 .
- ^ Jump up to: а б Харрис Т.Д., Бузби П.Р., Бэбкок Х., Бир Э., Бауэрс Дж., Браславский И. и др. (апрель 2008 г.). «Одномолекулярное секвенирование ДНК вирусного генома». Наука . 320 (5872): 106–9. Бибкод : 2008Sci...320..106H . дои : 10.1126/science.1150427 . ПМИД 18388294 . S2CID 16725564 .
- ^ Jump up to: а б Стрик Т.Р., Аллеманд Дж.Ф., Бенсимон Д., Бенсимон А., Крокетт В. (март 1996 г.). «Эластичность одной сверхспиральной молекулы ДНК». Наука . 271 (5257): 1835–7. Бибкод : 1996Sci...271.1835S . дои : 10.1126/science.271.5257.1835 . ПМИД 8596951 . S2CID 21790706 .
- ^ Jump up to: а б Госс К., Крокет V (июнь 2002 г.). «Магнитные пинцеты: микроманипуляции и измерение силы на молекулярном уровне» . Биофиз. Дж . 82 (6): 3314–29. Бибкод : 2002BpJ....82.3314G . дои : 10.1016/S0006-3495(02)75672-5 . ПМК 1302119 . ПМИД 12023254 .
- ^ Геллес Дж., Шнапп Б.Дж., Шитц член парламента (февраль 1988 г.). «Отслеживание движений, управляемых кинезином, с точностью до нанометра». Природа . 331 (6155): 450–3. Бибкод : 1988Natur.331..450G . дои : 10.1038/331450a0 . ПМИД 3123999 . S2CID 4277258 .
- ^ Эссеваз-Руле Б, Бокельманн Ю, Хесло Ф (октябрь 1997 г.). «Механическое разделение комплементарных цепей ДНК» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 94 (22): 11935–40. Бибкод : 1997PNAS...9411935E . дои : 10.1073/pnas.94.22.11935 . ПМК 23661 . ПМИД 9342340 .
- ^ Jump up to: а б Линнарссон С. (март 2012 г.). «Магнитное секвенирование». Нат. Методы . 9 (4): 339–341. дои : 10.1038/nmeth.1934 . ПМИД 22453909 . S2CID 5328249 .
- ^ МакНелли Б, Сингер А, Ю З, Сунь Ю, Венг З, Меллер А (июнь 2010 г.). «Оптическое распознавание конвертированных нуклеотидов ДНК для секвенирования одиночных молекул ДНК с использованием массивов нанопор» . Нано Летт . 10 (6): 2237–44. Бибкод : 2010NanoL..10.2237M . дои : 10.1021/nl1012147 . ПМК 2883017 . ПМИД 20459065 .
- ^ Мир КУ, Ци Х, Салата О, Скоззафава Г (январь 2009 г.). «Секвенирование методом циклического лигирования и расщепления (CycLiC) непосредственно на захваченном шаблоне микрочипа» . Нуклеиновые кислоты Рез . 37 (1): e5. дои : 10.1093/нар/gkn906 . ПМК 2615607 . ПМИД 19015154 .
- ^ Шадт Э.Э., Тернер С., Касарскис А. (октябрь 2010 г.). «Окно в секвенирование третьего поколения» . Хм. Мол. Жене . 19 (Р2): 227–40 Рэндов. дои : 10.1093/hmg/ddq416 . ПМИД 20858600 .
- ^ Технические характеристики Illumina HiSeq 2000, заархивированные 13 марта 2013 г. на Wayback Machine.