Полногеномное бисульфитное секвенирование
Полногеномное бисульфитное секвенирование — это технология секвенирования нового поколения, используемая для определения статуса метилирования ДНК отдельных цитозинов путем обработки ДНК бисульфитом натрия перед высокопроизводительным секвенированием ДНК . Статус метилирования ДНК различных генов может раскрыть информацию о регуляции генов и транскрипционной активности. [ 1 ] Этот метод был разработан в 2009 году вместе с бисульфитным секвенированием с уменьшенным представлением после того, как бисульфитное секвенирование стало золотым стандартом для анализа метилирования ДНК. [ 2 ] [ 3 ]
Полногеномное бисульфитное секвенирование измеряет уровни метилирования одиночного цитозина по всему геному и напрямую оценивает соотношение метилированных молекул, а не уровни обогащения. В настоящее время этот метод распознал и протестировал примерно 95% всех цитозинов в известных геномах. [ 4 ] Благодаря совершенствованию методов подготовки библиотек и технологии секвенирования нового поколения за последнее десятилетие полногеномное бисульфитное секвенирование становится все более распространенным и информативным методом анализа метилирования ДНК в общеэпигеномных исследованиях. [ 5 ]
История
[ редактировать ]До разработки полногеномного бисульфитного секвенирования анализ метилирования генома в значительной степени опирался на ранние неспецифические и дифференциальные методы, такие как бумажная хроматография , высокоэффективная жидкостная хроматография и тонкослойная хроматография для анализа профилей метилирования. [ 6 ] Эти методы были ограничены невозможностью амплифицировать метилированную ДНК с помощью полимеразной цепной реакции in vitro из-за потери статуса метилирования. [ 6 ] В результате большая часть этих ранних методов основывалась на обнаружении и анализе естественно проявленных метилированных цитозинов in vivo, а не на химически метилированных цитозинах.
В 1970 году произошел прорыв, когда было обнаружено, что обработка ДНК бисульфитом натрия дезаминирует остатки цитозина в урацил. [ 6 ] В следующем десятилетии это открытие привело к открытию, что неметилированный цитозин гораздо быстрее реагировал на обработку бисульфитом натрия, чем 5-метилцитозин . Эта разница в скорости реакций создала возможность идентификации химических изменений в ДНК как легко обнаруживаемого генетического маркера. [ 6 ] Полногеномное бисульфитное секвенирование было получено как комбинация этой бисульфитной обработки и технологии секвенирования следующего поколения, такой как секвенирование дробовиком .
Метод полногеномного секвенирования был впервые применен для картирования метилирования ДНК с разрешением в один нуклеотид на Arabidopsis thaliana в 2008 году, а вскоре после этого, в 2009 году, была создана первая карта метилирования ДНК всего генома человека с разрешением в одно основание с использованием полногеномного бисульфита. секвенирование. [ 7 ] [ 5 ] С момента его разработки было разработано множество различных протоколов полногеномного бисульфитного секвенирования с целью повышения эффективности и результативности его одноосновного картирования. Поскольку стоимость секвенирования следующего поколения снизилась, полногеномное бисульфитное секвенирование стало более широко использоваться в клинических и экспериментальных исследованиях. [ 3 ] В настоящее время создано множество общедоступных наборов геномных данных, и этот метод распознал и протестировал примерно 95% всех цитозинов в известных геномах. [ 4 ]
Метод
[ редактировать ]Следующие шаги вытекают из одного потенциального рабочего процесса обычного полногеномного бисульфитного секвенирования: извлечение целевой ДНК, преобразование бисульфита, амплификация библиотеки и биоинформатический анализ. [ 8 ] Однако различные системы секвенирования и инструменты анализа часто адаптируют технические параметры и порядок следующих этапов процессов, чтобы оптимизировать охват и эффективность анализа. [ 3 ]
экстракция ДНК
[ редактировать ]Протоколы подготовки библиотеки подвергаются фрагментации ДНК, восстановлению концов, хвостовику dA и лигированию адаптера перед обработкой бисульфитом и амплификацией библиотеки. Стандартная фрагментация с использованием высокопроизводительных технологий, таких как Illumina Genome Analyser и Solexa, требует распыления для создания фрагментов в диапазоне от 0 до 1200 пар оснований. [ 9 ] После фрагментации ферменты репарации концов и дополнительные адаптеры затем применяются к ДНК в ходе полимеразной цепной реакции с препарированием концов и реакции лигирования адаптера соответственно. Выбор размера происходит до обработки ДНК бисульфитом натрия.
Обычные методы подготовки эукариотической ДНК во время секвенирования используют самые разные количества входной ДНК: от всего лишь 10 нг для новых альтернативных библиотек NGS, таких как метод тагментации, до 500-1000 нг ДНК в качестве входного образца. [ 10 ]
Бисульфитная конверсия
[ редактировать ]Образец ДНК, лигированный с адаптером, обрабатывают бисульфитом натрия, химическим соединением, которое превращает неметилированные цитозины в урацил , при низком pH и высоких температурах. [ 11 ] [ 12 ] Химическая реакция изображена на рисунке 1, где сульфирование происходит в положении углерода-6 цитозина с образованием промежуточного сульфоната цитозина. [ 13 ] Затем это промежуточное соединение подвергается необратимому гидролитическому дезаминированию с образованием сульфоната урацила. В щелочных условиях сульфонат урацила десульфируется с образованием урацила. [ 13 ]
Это позволяет обнаруживать метилирование, отличая метилированные цитозины (5-метилцитозин), которые устойчивы к обработке бисульфитом, от урацила. В ходе амплификации с помощью полимеразной цепной реакции урацилы превращаются в тимины . [ 3 ] Метилированные цитозины тогда распознаются как цитозины. Их местоположение затем идентифицируется путем сравнения обработанной бисульфитом и исходной последовательности ДНК.
После обработки бисульфитом требуется очистка образца для удаления нежелательных продуктов, включая соли бисульфита. [ 13 ]
Усиление библиотеки
[ редактировать ]Чтобы амплифицировать библиотеку эпигенома, обработанную бисульфитом ДНК примируют для генерации ДНК со специфической последовательностью мечения. Затем 3'-конец этой последовательности снова помечается, создавая фрагменты ДНК с маркерами на обоих концах. Эти фрагменты амплифицируются в ходе заключительной полимеразной цепной реакции, после чего библиотека подготавливается для секвенирования путем синтеза. [ 8 ] Это продемонстрировано на рисунке 2, на котором высокопроизводительная система секвенирования, разработанная биотехнологической компанией Illumina, выполняет комплексные анализы, основанные на секвенировании путем синтеза пар оснований. [ 8 ]
Биоинформатический анализ
[ редактировать ]После амплификации библиотеки можно провести серию анализов расширенной библиотеки, чтобы определить различные характеристики метилирования или составить карту профиля метилирования по всему геному. [ 8 ]
В одном из таких исследований новые чтения сравниваются с эталонным геномом, чтобы напрямую сравнить расположение метилированных цитозинов и несоответствия CT. Для этого требуется программное обеспечение, такое как SOAP, для параллельного сравнения геномов. [ 8 ] Другой потенциальный анализ секвенирования — это вызов метилированного цитозина, который вычисляет соотношения метилированного цитозина путем сопоставления вероятностей на основе качества чтения. Это помогает определить расположение метилированного цитозина в геноме. [ 8 ] Наконец, глобальные тенденции изменения метилома можно проанализировать, рассчитав коэффициенты распределения CG, CHGG и CHH в метилированных цитозинах по геному. [ 8 ] Эти соотношения могут отражать особенности карт метилирования всего генома определенных видов.
Приложения
[ редактировать ]Благодаря своей способности проверять статус метилирования с разрешением в один нуклеотид по всему данному геному, полногеномное бисульфитное секвенирование становится все более многообещающим в содействии фундаментальным эпигеномным исследованиям, новым гипотезам о метилировании ДНК и исследованиям будущих крупномасштабных эпидемиологических исследований. [ 3 ] [ 5 ] Этот полногеномный подход также способен чувствительно обнаруживать метилирование цитозина в определенных последовательностях по всему геному, что увеличивает его потенциал для идентификации конкретных сайтов метилирования ДНК и их связи с определенными экспрессиями генов. [ 6 ]
Метилирование ДНК
[ редактировать ]Метод полногеномного бисульфитного секвенирования способен чувствительно обнаруживать метилирование цитозина в определенных последовательностях по всему геному, что увеличивает его потенциал для идентификации конкретных сайтов метилирования ДНК и их связи с определенными экспрессиями генов. [ 6 ] Использование полногеномного бисульфитного секвенирования для создания первого метилома ДНК человека в 2009 году также помогло выявить значительную долю метилирования, не связанного с CG. [ 6 ] В результате продолжают создаваться множественные метиломы с одноосновным разрешением генома человека, чтобы определить роль внутригенного метилирования ДНК в экспрессии и регуляции генов. Будущие исследования направлены на использование полногеномного бисульфитного секвенирования для изучения роли метилирования ДНК в различных клеточных процессах, таких как клеточная дифференциация , эмбриогенез , Х-инактивация, геномный импринтинг и онкогенез . [ 4 ] Однонуклеотидные карты уже секвенированы для двух клеточных линий человека, эмбриональных стволовых клеток человека H1 и фибробластов легких плода IMR90, чтобы изучить закономерности не-CG-метилирования в клетках человека. [ 4 ]
Биология развития
[ редактировать ]Полногеномное бисульфитное секвенирование также применялось в исследованиях биологии развития, в которых было обнаружено, что не-CG-метилирование преобладает в плюрипотентных стволовых клетках и ооцитах. Этот метод помог исследователям обнаружить, что метилирование, не связанное с CG, накапливается во время роста ооцитов и покрывает более половины всего метилирования в ооцитах зародышевых пузырьков мыши. [ 14 ] Аналогично, у растений полногеномное бисульфитное секвенирование использовалось для изучения CG, CHH и CHG. [ нужны разъяснения ] метилирование. Затем было обнаружено, что зародышевая линия растений сохранила метилирование CG и CHG, в то время как млекопитающие потеряли метилирование CHH в микроспорах и сперматозоидах. [ 14 ]
Другие поля
[ редактировать ]Неограниченные ресурсы, предоставляемые подходом полного генома, стимулировали появление множества новых гипотез о том, как полногеномное бисульфитное секвенирование можно использовать в других различных областях, включая диагностику заболеваний и судебную медицину. Исследования показали, что полногеномное бисульфитное секвенирование может выявить аномальное метилирование или, точнее, гиперметилированные гены-супрессоры, которые часто наблюдаются при раке, включая лейкемию. [ 14 ] Кроме того, полногеномное бисульфитное секвенирование применялось к образцам пятен крови в судебно-медицинских исследованиях для получения высококачественных анализов метилирования ДНК на высушенных пятнах. [ 14 ]
Ограничения
[ редактировать ]Технические проблемы
[ редактировать ]Широкое использование полногеномного бисульфитного секвенирования было в первую очередь ограничено его чрезмерной стоимостью, сложным выводом данных и минимальным необходимым охватом. Из-за большого количества и последующей стоимости ввода ДНК многие исследования с использованием полногеномного бисульфитного секвенирования проводятся с небольшим количеством биологических повторов или вообще без них. [ 15 ] Для человеческих образцов проект «Дорожная карта эпигеномики» Национального института здравоохранения США (NIH) рекомендует секвенирование как минимум с 30-кратным охватом для достижения точных результатов и примерно 80 миллионов выровненных высококачественных считываний. [ 16 ] Следовательно, крупномасштабные исследования по профилированию метилирования в масштабах всего генома остаются менее экономически эффективными, часто требуя многократного повторного секвенирования всего генома несколько раз для каждого эксперимента. [ 17 ] В настоящее время проводятся исследования, направленные на снижение обычных минимальных требований к охвату при сохранении точности картографирования.
Наконец, этот метод также ограничен сложностью данных и отсутствием достаточно продвинутых аналитических инструментов для последующих вычислительных потребностей. [ 2 ] Текущие требования биоинформатики к точной интерпретации данных опережают существующие технологии, что затрудняет доступность результатов секвенирования для широкой публики.
Предвзятости и чрезмерная представленность метилирования ДНК
[ редактировать ]Кроме того, существуют биологические ограничения, касающиеся различных этапов стандартного протокола, особенно метода подготовки библиотеки. Одной из самых больших проблем является потенциальная ошибка в базовом составе последовательностей и чрезмерное представление данных о метилированной ДНК после биоинформатического анализа. [ 9 ] Смещение может возникнуть из-за множества непреднамеренных эффектов преобразования бисульфита, включая деградацию ДНК. Эта деградация может вызвать неравномерное покрытие последовательностей из-за искажения геномных последовательностей и завышения значений 5-метилцитозина. [ 3 ] Кроме того, процесс преобразования бисульфита отличает только неметилированный цитозин от 5-метилцитозина. В результате специфичность между 5-метилцитозином и 5-гидроксиметилцитозином ограничена. [ 3 ] Другой потенциальный источник систематической ошибки связан с амплификацией библиотеки полимеразной цепной реакцией, которая влияет на последовательности с сильно искаженным базовым составом из-за высокого уровня ошибок полимеразной последовательности в ДНК с высоким содержанием АТ и бисульфит-конвертированной ДНК. [ 3 ]
См. также
[ редактировать ]- Бисульфитное секвенирование с уменьшенным представлением
- Метилирование ДНК
- Последовательность дробовика
- ChIP-секвенирование
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Кавакацу, Тайдзи (2020), Васкетто, Луис М. (редактор), «Полногеномное бисульфитное секвенирование и эпигенетические вариации метиломов зерновых» , Геномика зерновых: методы и протоколы , Методы молекулярной биологии, том. 2072, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Springer US, стр. 119–128, doi : 10.1007/978-1-4939-9865-4_10 , ISBN. 978-1-4939-9865-4 , PMID 31541442 , S2CID 202711452 , получено 14 ноября 2021 г.
- ^ Jump up to: а б Стирзакер, Клэр; Таберли, Филиппа К.; Стэтхэм, Аарон Л.; Кларк, Сьюзен Дж. (01 февраля 2014 г.). «Добыча метиломов рака: перспективы и проблемы» . Тенденции в генетике . 30 (2): 75–84. дои : 10.1016/j.tig.2013.11.004 . ISSN 0168-9525 . ПМИД 24368016 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж г час Олова, Нелли; Крюгер, Феликс; Эндрюс, Саймон; Оксли, Дэвид; Берренс, Ребекка В.; Бранко, Мигель Р.; Рейк, Вольф (15 марта 2018 г.). «Сравнение стратегий подготовки библиотеки полногеномного бисульфитного секвенирования выявляет источники систематических ошибок, влияющих на данные метилирования ДНК» . Геномная биология . 19 (1): 33. дои : 10.1186/s13059-018-1408-2 . ISSN 1474-760X . ПМЦ 5856372 . ПМИД 29544553 .
- ^ Jump up to: а б с д Листер, Райан; Пелиццола, Маттиа; Дауэн, Роберт Х.; Хокинс, Р. Дэвид; Дорогой, Гэри; Тонти-Филиппини, Джулиан; Нери, Джозеф Р.; Ли, Леонард; Йе, Чжэнь; Нго, Ке-Мин; Эдсолл, Ли (14 октября 2009 г.). «Метиломы ДНК человека при разрешении оснований демонстрируют широко распространенные эпигеномные различия» . Природа . 462 (7271): 315–322. Бибкод : 2009Natur.462..315L . дои : 10.1038/nature08514 . ISSN 1476-4687 . ПМК 2857523 . ПМИД 19829295 .
- ^ Jump up to: а б с Чжоу, Ли; Нг, Хонг Киат; Драуц-Мозес, Даниэла И.; Шустер, Стефан К.; Бек, Стефан; Ким, Чанхун; Чемберс, Джон Кэмпбелл; Ло, Мари (17 июля 2019 г.). «Систематическая оценка методов подготовки библиотек и платформ секвенирования для высокопроизводительного полногеномного бисульфитного секвенирования» . Научные отчеты . 9 (1): 10383. Бибкод : 2019NatSR...910383Z . дои : 10.1038/s41598-019-46875-5 . ISSN 2045-2322 . ПМК 6637168 . ПМИД 31316107 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж г Парл-Макдермотт, Энн; Харрисон, Алан (2011). «Метилирование ДНК: хронология методов и приложений» . Границы генетики . 2 : 74. дои : 10.3389/fgene.2011.00074 . ISSN 1664-8021 . ПМЦ 3268627 . ПМИД 22303369 .
- ^ Кокус, Шон Дж.; Фэн, Сухуа; Чжан, Сяоюй; Чен, Зуген; Мерриман, Барри; Хауденшильд, Кристиан Д.; Прадхан, Шрихарша; Нельсон, Стэнли Ф.; Пеллегрини, Маттео; Якобсен, Стивен Э. (17 февраля 2008 г.). «Бисульфитное секвенирование генома Arabidopsis выявляет закономерности метилирования ДНК» . Природа . 452 (7184): 215–219. Бибкод : 2008Natur.452..215C . дои : 10.1038/nature06745 . ISSN 1476-4687 . ПМК 2377394 . ПМИД 18278030 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж г час «Принципы и рабочий процесс полногеномного бисульфитного секвенирования - геномика CD» . www.cd-genomics.com . Проверено 3 ноября 2021 г.
- ^ Jump up to: а б Перепел, Майкл А.; Козарева, Иванка; Смит, Фрэнсис; Скалли, Эйлвин; Стивенс, Филип Дж.; Дурбин, Ричард; Свердлов, Гарольд; Тернер, Дэниел Дж. (25 ноября 2008 г.). «Усовершенствования крупного геномного центра в системе секвенирования Illumina» . Природные методы . 5 (12): 1005–1010. дои : 10.1038/nmeth.1270 . ISSN 1548-7105 . ПМК 2610436 . ПМИД 19034268 .
- ^ Ван, Ци; Гу, Лей; Эйди, Эндрю; Радльвиммер, Бернхард; Ван, Вэй; Ховестадт, Волкер; Бэр, Марион; Вольф, Стефан; Шендюр, Джей; Эйлс, Роланд; Пласс, Кристоф (26 сентября 2013 г.). «Полногеномное бисульфитное секвенирование на основе тагментации» . Протоколы природы . 8 (10): 2022–2032. дои : 10.1038/nprot.2013.118 . ISSN 1750-2799 . ПМИД 24071908 . S2CID 12706151 .
- ^ Фроммер, М; Макдональд, Луизиана; Миллар, Д.С.; Коллис, CM; Ватт, Ф; Григг, ГВ; Моллой, Польша; Пол, CL (1 марта 1992 г.). «Протокол геномного секвенирования, который дает положительное отображение остатков 5-метилцитозина в отдельных цепях ДНК» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 89 (5): 1827–1831. Бибкод : 1992PNAS...89.1827F . дои : 10.1073/pnas.89.5.1827 . ISSN 0027-8424 . ПМЦ 48546 . ПМИД 1542678 .
- ^ Кларк, С.Дж.; Харрисон, Дж; Пол, CL; Фроммер, М. (11 августа 1994 г.). «Высокочувствительное картирование метилированных цитозинов» . Исследования нуклеиновых кислот . 22 (15): 2990–2997. дои : 10.1093/нар/22.15.2990 . ISSN 0305-1048 . ПМК 310266 . ПМИД 8065911 .
- ^ Jump up to: а б с Кристенсен, Лассе Зоммер; Хансен, Лиза (1 июля 2009 г.). «Методы ПЦР для обнаружения биомаркеров однолокусного метилирования ДНК в диагностике рака, прогностике и ответе на лечение» . Клиническая химия . 55 (8): 1471–83. дои : 10.1373/clinchem.2008.121962 . ПМИД 19520761 .
- ^ Jump up to: а б с д «Применение полногеномного бисульфитного секвенирования (WGBS)» . Новости-Medical.net . 31 октября 2018 г. Проверено 17 ноября 2021 г.
- ^ Ву, Хао; Сюй, Тяньлэй; Фэн, Хао; Чен, Ли; Ли, Бен; Яо, Бинг; Цинь, Чжаохуэй; Цзинь, Пэн; Коннили, Карен Н. (2 декабря 2015 г.). «Обнаружение дифференциально метилированных областей по данным полногеномного бисульфитного секвенирования без повторов» . Исследования нуклеиновых кислот . 43 (21): е141. дои : 10.1093/nar/gkv715 . ISSN 0305-1048 . ПМЦ 4666378 . ПМИД 26184873 .
- ^ Зиллер, Майкл Дж.; Хансен, Каспер Д.; Мейснер, Александр; Ари, Мартин Дж. (2 ноября 2014 г.). «Рекомендации по охвату анализа метилирования путем полногеномного бисульфитного секвенирования» . Природные методы . 12 (3): 230–232. дои : 10.1038/nmeth.3152 . ISSN 1548-7105 . ПМЦ 4344394 . ПМИД 25362363 .
- ^ Стивенс, Майкл; Ченг, Джеффри Б.; Ли, Даофэн; Се, Минчао; Хонг, Чибо; Мэр, Сесиль Л.; Лигон, Кейт Л.; Херст, Мартин; Марра, Марко А.; Костелло, Джозеф Ф.; Ван, Тин (23 сентября 2013 г.). «Оценка абсолютного уровня метилирования при разрешении одиночного CpG на основе методов секвенирования ферментов рестрикции и обогащения метилирования» . Геномные исследования . 23 (9): 1541–1553. дои : 10.1101/гр.152231.112 . ISSN 1088-9051 . ПМЦ 3759729 . ПМИД 23804401 .