✖


Jump to content

Бисульфитное секвенирование

Рисунок 1: Схема бисульфитной конверсии образца последовательности геномной ДНК. Нуклеотиды синего цвета представляют собой неметилированные цитозины, преобразованные в урацилы бисульфитом, а красные нуклеотиды представляют собой 5-метилцитозины, устойчивые к преобразованию.
Рисунок 2: Схема химической реакции, лежащей в основе катализируемого бисульфитом превращения цитозина в урацил.

Бисульфит [1] секвенирование (также известное как бисульфитное секвенирование ) — это использование бисульфитной обработки ДНК перед рутинным секвенированием для определения характера метилирования . Метилирование ДНК было первой обнаруженной эпигенетической меткой и остается наиболее изученной. У животных он преимущественно включает добавление метильной группы к положению углерода-5 остатков цитозина динуклеотида CpG и участвует в репрессии транскрипционной активности .

Обработка ДНК бисульфитом превращает остатки цитозина в урацил , но оставляет остатки 5-метилцитозина незатронутыми. Следовательно, ДНК, обработанная бисульфитом, сохраняет только метилированные цитозины. Таким образом, обработка бисульфитом вносит специфические изменения в последовательность ДНК , которые зависят от статуса метилирования отдельных остатков цитозина, что дает информацию с разрешением одного нуклеотида о статусе метилирования сегмента ДНК. Для получения этой информации можно выполнить различные анализы измененной последовательности. Таким образом, цель этого анализа сводится к дифференциации однонуклеотидных полиморфизмов (цитозинов и тимидина ), возникающих в результате конверсии бисульфита (рис. 1).

Методы

[ редактировать ]

При бисульфитном секвенировании применяются обычные методы секвенирования геномной ДНК, обработанной бисульфитом, для определения статуса метилирования динуклеотидов CpG. Другие стратегии, не связанные с секвенированием, также используются для исследования метилирования в определенных локусах или на уровне всего генома . Все стратегии предполагают, что бисульфит-индуцированное превращение неметилированных цитозинов в урацил завершено, и это служит основой всех последующих методов. В идеале используемый метод должен определять статус метилирования отдельно для каждой аллели . Альтернативные методы бисульфитного секвенирования включают комбинированный бисульфитный рестрикционный анализ и иммунопреципитацию метилированной ДНК (MeDIP).

Методики анализа ДНК, обработанной бисульфитом, постоянно разрабатываются. Для обобщения этих быстро развивающихся методологий было написано множество обзорных статей. [2] [3] [4] [5]

В целом методологии можно разделить на стратегии, основанные на ПЦР, специфичной для метилирования (MSP) (рис. 4), и стратегии, использующие полимеразную цепную реакцию (ПЦР), выполняемую в условиях, не специфичных для метилирования (рис. 3). В методах, основанных на микрочипах, также используется ПЦР, основанная на условиях, неспецифичных для метилирования.

Методы ПЦР, не специфичные для метилирования

[ редактировать ]
Рисунок 3: Методы анализа метилирования ДНК, не основанные на ПЦР, специфичной для метилирования. После бисульфитной конверсии геномную ДНК амплифицируют с помощью ПЦР, которая не делает различия между метилированными и неметилированными последовательностями. Затем используются многочисленные доступные методы для дискриминации на основе изменений внутри ампликона в результате преобразования бисульфита.

Прямое секвенирование

[ редактировать ]

В первом опубликованном методе анализа метилирования с использованием ДНК, обработанной бисульфитом, использовалась ПЦР и стандартное секвенирование ДНК дидезоксинуклеотидов для прямого определения нуклеотидов, устойчивых к преобразованию бисульфита. [6] Праймеры разработаны так, чтобы быть специфичными для цепи, а также бисульфит-специфичными (т.е. праймеры, содержащие не-CpG цитозины, так что они не комплементарны ДНК, не обработанной бисульфитом), фланкирующие (но не вовлекающие) интересующий сайт метилирования. Следовательно, он будет амплифицировать как метилированные, так и неметилированные последовательности, в отличие от ПЦР, специфичной для метилирования. Все сайты неметилированных цитозинов представлены в виде тиминов в результирующей амплифицированной последовательности смысловой цепи и в виде аденинов в амплифицированной антисмысловой цепи. Благодаря включению адаптеров высокопроизводительного секвенирования в праймеры для ПЦР продукты ПЦР можно секвенировать с помощью массово-параллельного секвенирования. Альтернативно и трудоемко, продукт ПЦР можно клонировать и секвенировать. Методы вложенной ПЦР можно использовать для улучшения качества продукта при секвенировании .

Все последующие методы анализа метилирования ДНК с использованием ДНК, обработанной бисульфитом, основаны на этом отчете Frommer et al. (рис. 2). [6] Хотя большинство других методов не являются истинными методами, основанными на секвенировании, термин «бисульфитное секвенирование» часто используется для описания методов анализа метилирования ДНК с бисульфитной конверсией в целом.

Пиросеквенирование

[ редактировать ]

Пиросеквенирование также использовалось для анализа ДНК, обработанной бисульфитом, без использования ПЦР, специфичной для метилирования. [7] [8] После ПЦР-амплификации интересующей области пиросеквенирование используется для определения преобразованной бисульфитом последовательности специфических сайтов CpG в этой области. Соотношение C-к-T в отдельных сайтах можно определить количественно на основе количества включения C и T во время расширения последовательности. Основным ограничением этого метода является стоимость технологии. Тем не менее, пиросеквенирование вполне позволяет расширить методы скрининга с высокой пропускной способностью .

Вариант этой методики, описанный Wong et al. , использует аллель-специфичные праймеры, которые включают однонуклеотидные полиморфизмы в последовательность праймера для секвенирования, что позволяет проводить раздельный анализ материнских и отцовских аллелей . [9] Этот метод особенно полезен для анализа геномного импринтинга .

Чувствительный к метилированию одноцепочечный конформационный анализ (MS-SSCA)

[ редактировать ]

Этот метод основан на методе анализа одноцепочечного конформационного полиморфизма (SSCA), разработанном для анализа однонуклеотидного полиморфизма (SNP). [10] SSCA различает одноцепочечные фрагменты ДНК одинакового размера, но различной последовательности на основе дифференциальной миграции при неденатурирующем электрофорезе . В MS-SSCA это используется для различения обработанных бисульфитом и амплифицированных ПЦР областей, содержащих интересующие сайты CpG. Хотя SSCA не обладает чувствительностью, когда присутствует разница только в один нуклеотид , обработка бисульфитом часто приводит к ряду преобразований C-to-T в большинстве интересующих областей, и результирующая чувствительность приближается к 100%. MS-SSCA также обеспечивает полуколичественный анализ степени метилирования ДНК на основе соотношения интенсивностей полос. Однако этот метод предназначен для оценки всех сайтов CpG в целом в интересующей области, а не отдельных сайтов метилирования.

Анализ плавления высокого разрешения (HRM)

[ редактировать ]

Еще одним методом дифференциации преобразованной ДНК от непреобразованной, обработанной бисульфитом, является использование анализа плавления высокого разрешения (HRM), количественного метода на основе ПЦР , первоначально разработанного для различения SNP. [11] ПЦР Ампликоны анализируются непосредственно путем изменения температуры и, как следствие, высвобождения интеркалирующего флуоресцентного красителя во время плавления. Степень метилирования, представленная содержанием C-to-T в ампликоне , определяет скорость плавления и последующее высвобождение красителя. Этот метод позволяет проводить прямой количественный анализ в одной пробирке, но оценивает метилирование в амплифицированной области в целом, а не в конкретных сайтах CpG .

Расширение однонуклеотидного праймера, чувствительного к метилированию (MS-SnuPE)

[ редактировать ]

MS-SnuPE использует метод удлинения праймера, изначально разработанный для анализа однонуклеотидных полиморфизмов . [12] ДНК подвергается бисульфитному преобразованию, и специфичные для бисульфита праймеры отжигаются с последовательностью до пары оснований непосредственно перед интересующим CpG. Праймеру позволяют удлинить одну пару оснований до C (или T) с помощью ДНК-полимеразой , оканчивающихся дидезоксинуклеотидов , и соотношение C и T определяют количественно.

Для определения этого соотношения C:T можно использовать ряд методов. Вначале MS-SnuPE полагался на радиоактивные ddNTP в качестве репортера расширения праймера. методы на основе флуоресценции или пиросеквенирование . Также можно использовать [13] анализ с помощью матричной лазерной десорбции и ионизации/времени пролета ( MALDI-TOF ) Однако масс-спектрометрический для различения двух полиморфных продуктов удлинения праймера может быть использован, по сути, на основе анализа GOOD, разработанного для генотипирования SNP . Ионно-парная высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой (IP-RP- ВЭЖХ ) также использовалась для различения продуктов удлинения праймера. [14]

Расщепление по основанию/MALDI-TOF

[ редактировать ]

Недавно описанный метод Ehrich et al. дополнительно использует преимущества бисульфитных преобразований, добавляя стадию расщепления, специфичного для оснований, для улучшения информации, полученной в результате изменений нуклеотидов. [15] Используя сначала транскрипцию интересующей области в РНК in vitro (путем добавления РНК-полимеразы сайта промотора к праймеру ПЦР при первоначальной амплификации), РНКазу А можно использовать для расщепления РНК транскрипта в сайтах, специфичных для оснований. Поскольку РНКаза А расщепляет РНК специфически по рибонуклеотидам цитозина и урацила , специфичность по основаниям достигается за счет добавления устойчивого к расщеплению dTTP , когда желательно цитозин-специфическое (C-специфическое) расщепление, и включения dCTP, когда урацил-специфическое (U-специфическое) расщепление. желательно. Расщепленные фрагменты затем можно проанализировать с помощью MALDI-TOF . Обработка бисульфитом приводит либо к введению/удалению сайтов расщепления за счет превращений C-в-U, либо к сдвигу массы фрагмента за счет превращений G-в-A в амплифицированной обратной цепи. C-специфическое расщепление будет специфично разрезаться по всем метилированным сайтам CpG . Анализируя размеры полученных фрагментов, можно определить конкретный характер метилирования ДНК CpG-сайтов внутри региона, а не определить степень метилирования региона в целом. Этот метод продемонстрировал эффективность для высокопроизводительный скрининг исследовать многочисленные сайты CpG , позволяющий экономически эффективно во многих тканях.

ПЦР, специфичная для метилирования (MSP)

[ редактировать ]
Рисунок 4. ПЦР, специфичная для метилирования, представляет собой чувствительный метод избирательной амплификации и обнаружения интересующей метилированной области с использованием специфичных к метилированию праймеров на геномной ДНК, преобразованной бисульфитом. Такие праймеры будут отжигаться только с метилированными последовательностями и, следовательно, содержащими 5-метилцитозины , устойчивые к преобразованию бисульфитом. Альтернативно можно использовать неметилированные специфические праймеры.

Этот альтернативный метод анализа метилирования также использует ДНК, обработанную бисульфитом, но позволяет избежать необходимости секвенировать интересующую область. [16] Вместо этого пары праймеров сами разрабатываются так, чтобы быть «специфичными к метилированию» путем включения последовательностей, дополняющих только непреобразованные 5-метилцитозины , или, наоборот, «неметилированных», дополняющих тимины , преобразованные из неметилированных цитозинов. Метилирование определяется способностью конкретного праймера достигать амплификации. Этот метод особенно полезен для исследования CpG-островков с возможно высокой плотностью метилирования, поскольку увеличение количества пар CpG в праймере повышает специфичность анализа. Размещение пары CpG на 3'-конце праймера также повышает чувствительность. В первоначальном отчете с использованием MSP описывалась достаточная чувствительность для обнаружения метилирования 0,1% аллелей . В целом, MSP и связанные с ним протоколы считаются наиболее чувствительными при проверке статуса метилирования в определенном локусе .

Метод MethyLight основан на MSP, но обеспечивает количественный анализ с помощью количественной ПЦР . [17] Используются специфичные для метилирования праймеры, а также репортерный зонд флуоресценции, специфичный для метилирования, который отжигается с амплифицированной областью. Альтернативно, праймеры или зонды могут быть созданы без специфичности метилирования, если необходимо различать пары CpG внутри задействованных последовательностей. Количественное определение проводят относительно метилированной эталонной ДНК. Модификация этого протокола для повышения специфичности ПЦР для успешно преобразованной бисульфитом ДНК (ConLight-MSP) использует дополнительный зонд для непреобразованной бисульфитом ДНК для количественной оценки этой неспецифической амплификации. [18]

Дальнейшая методика с использованием MSP-амплифицированной ДНК анализирует продукты с использованием анализа кривой плавления (Mc-MSP). [19] Этот метод амплифицирует преобразованную бисульфитом ДНК как с метилированными, так и с неметилированными специфичными праймерами и определяет количественное соотношение двух продуктов путем сравнения дифференциальных пиков, полученных при анализе кривой плавления. Был внедрен метод анализа плавления с высоким разрешением, который использует как количественную ПЦР, так и анализ плавления, в частности, для чувствительного обнаружения низкого уровня метилирования. [20]

Методы на основе микрочипов

[ редактировать ]

Методы на основе микрочипов являются логическим продолжением технологий, доступных для анализа ДНК, обработанной бисульфитом, и позволяют проводить полногеномный анализ метилирования. [21] Олигонуклеотидные микрочипы создаются с использованием пар олигонуклеотидных гибридизационных зондов, нацеленных на сайты CpG интересующие . Один комплементарен неизмененной метилированной последовательности, а другой комплементарен неметилированной последовательности, преобразованной из C в U. Зонды также являются бисульфит-специфичными, что предотвращает связывание с ДНК, неполностью преобразованной бисульфитом. — Анализ метилирования Illumina это один из таких анализов, в котором применяется технология бисульфитного секвенирования на уровне микрочипов для получения данных о метилировании всего генома.

Ограничения

[ редактировать ]

5-гидроксиметилцитозин

[ редактировать ]

Бисульфитное секвенирование широко используется в геномах млекопитающих, однако возникли осложнения с открытием новой модификации ДНК млекопитающих 5-гидроксиметилцитозина . [22] [23] 5-Гидроксиметилцитозин превращается в цитозин-5-метилсульфонат при обработке бисульфитом, который затем читается как C при секвенировании. [24] Следовательно, бисульфитное секвенирование не может различать 5-метилцитозин и 5-гидроксиметилцитозин. Это означает, что результат бисульфитного секвенирования больше нельзя определять как исключительно метилирование ДНК, поскольку он представляет собой смесь 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина. Разработка Чуан Хэ в Чикагском университете окислительного бисульфитного секвенирования с помощью Tet теперь позволяет различать две модификации с разрешением по одному основанию. [25]

Неполное преобразование

[ редактировать ]

Бисульфитное секвенирование основано на превращении каждого неметилированного остатка цитозина в урацил. Если конверсия неполная, последующий анализ будет неправильно интерпретировать непреобразованные неметилированные цитозины как метилированные цитозины, что приведет к ложноположительным результатам по метилированию. Только цитозины в одноцепочечной ДНК подвержены атаке бисульфита, поэтому денатурация анализируемой ДНК имеет решающее значение. [2] Важно убедиться, что такие параметры реакции, как температура и концентрация соли, подходят для поддержания ДНК в одноцепочечной конформации и обеспечивают полное преобразование. встраивание ДНК в агарозный гель повышает скорость конверсии за счет физического разделения цепей ДНК. Сообщается, что [26] Неполные показатели конверсии можно оценить и скорректировать после секвенирования, включив в библиотеку секвенирования внутренний контроль, такой как ДНК фага лямбда (которая, как известно, неметилирована), или путем сопоставления результатов бисульфитного секвенирования с известной неметилированной областью в организме. например, геном хлоропласта. [27]

Деградация ДНК при обработке бисульфитом

[ редактировать ]

Основной проблемой бисульфитного секвенирования является деградация ДНК, происходящая одновременно с конверсией. Условия, необходимые для полной конверсии, такие как длительное время инкубации, повышенная температура и высокая концентрация бисульфита, могут привести к деградации около 90% инкубированной ДНК. [28] Учитывая, что исходное количество ДНК часто ограничено, такая обширная деградация может быть проблематичной. Деградация происходит в виде депуринации, приводящей к случайным разрывам нитей. [29] Следовательно, чем длиннее желаемый ПЦР ампликон , тем более ограниченным будет, вероятно, количество интактных молекул матрицы. Это может привести к сбою ПЦР-амплификации или потере количественно точной информации об уровнях метилирования в результате ограниченного отбора образцов молекул-матрицы. Таким образом, важно оценить степень деградации ДНК, возникающую в результате используемых условий реакции, и рассмотреть, как это повлияет на желаемый ампликон . Для минимизации деградации ДНК также можно использовать методы, такие как циклическое изменение температуры инкубации. [29]

В 2020 году биолаборатории Новой Англии разработали NEBNext Enzymatic Mmethyl-seq, альтернативный ферментативный подход, позволяющий минимизировать повреждение ДНК. [30]

Другие проблемы

[ редактировать ]

Потенциально значимой проблемой после обработки бисульфитом является неполное десульфирование пиримидиновых остатков из -за недостаточного подщелачивания раствора. Это может ингибировать некоторые ДНК-полимеразы , что затрудняет последующую ПЦР. Однако этой ситуации можно избежать, контролируя pH раствора, чтобы гарантировать завершение десульфирования. [2]

Последняя проблема заключается в том, что обработка бисульфитом значительно снижает уровень сложности образца, что может быть проблематичным, если необходимо выполнить несколько реакций ПЦР (2006). [5] Разработка праймеров более сложна, и более часта несоответствующая перекрестная гибридизация.

Приложения: полногеномный анализ метилирования.

[ редактировать ]

Достижения в области бисульфитного секвенирования привели к возможности их применения в масштабе всего генома , тогда как ранее глобальное измерение метилирования ДНК было возможно только с использованием других методов, таких как геномное сканирование по рестрикционным ориентирам . Картирование эпигенома человека рассматривается многими учеными как логическое продолжение завершения проекта «Геном человека» . [31] [32] Эта эпигеномная информация будет важна для понимания того, как функция генетической последовательности реализуется и регулируется. Поскольку эпигеном менее стабилен, чем геном, считается, что он важен во взаимодействиях гена и окружающей среды . [33]

Однако эпигеномное картирование по своей сути более сложное, чем секвенирование генома , поскольку эпигеном гораздо более изменчив, чем геном . Эпигеном человека меняется с возрастом, различается в разных тканях, изменяется под воздействием факторов окружающей среды и демонстрирует отклонения при заболеваниях. Однако такое богатое эпигеномное картирование, отражающее разные возрасты, типы тканей и болезненные состояния, может дать ценную информацию о нормальном функционировании эпигенетических меток, а также о механизмах, ведущих к старению и болезням.

Прямые преимущества эпигеномного картирования включают вероятные достижения в клонирования технологии . Считается, что неудачи в создании клонированных животных с нормальной жизнеспособностью и продолжительностью жизни являются результатом несоответствующих моделей эпигенетических меток. Кроме того, аберрантные паттерны метилирования хорошо характеризуются при многих видах рака . Глобальное гипометилирование приводит к снижению геномной стабильности, тогда как локальное гиперметилирование генов-супрессоров опухолей промоторов часто приводит к потере их функции . Конкретные закономерности метилирования указывают на конкретные типы рака, имеют прогностическую ценность и могут помочь выбрать лучший курс лечения. [32]

Крупномасштабные усилия по картированию эпигенома проводятся по всему миру и организованы в рамках проекта «Эпигеном человека» . [33] Это основано на многоуровневой стратегии, при которой бисульфитное секвенирование используется для получения профилей метилирования с высоким разрешением для ограниченного числа эталонных эпигеномов, в то время как менее тщательный анализ выполняется на более широком спектре образцов. Этот подход призван максимизировать понимание, полученное от заданного объема ресурсов, поскольку картирование всего генома с высоким разрешением остается дорогостоящим мероприятием.

Было показано, что анализ набора генов (например, с использованием таких инструментов, как DAVID и GoSeq) дает серьезные искажения, когда применяется к данным высокопроизводительного метилирования (например, полногеномное бисульфитное секвенирование); Было высказано предположение, что это можно исправить с помощью перестановок меток образцов или использования статистической модели для контроля различий в количестве зондов CpG/сайтов CpG, нацеленных на каждый ген. [34]

Окислительное бисульфитное секвенирование

[ редактировать ]

5-Метилцитозин и 5-гидроксиметилцитозин при бисульфитном секвенировании читаются как C. [24] Окислительное бисульфитное секвенирование — это метод распознавания 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина с разрешением по одному основанию. В этом методе используется специфическое (с помощью Tet) химическое окисление 5-гидроксиметилцитозина до 5-формилцитозина, который впоследствии превращается в урацил во время обработки бисульфитом. [35] Единственное основание, которое затем читается как C, — это 5-метилцитозин, что дает карту истинного статуса метилирования в образце ДНК. Уровни 5-гидроксиметилцитозина также можно определить количественно, измеряя разницу между бисульфитным и окислительным бисульфитным секвенированием.

См. также

[ редактировать ]

Ссылки

[ редактировать ]
  1. ^ Чаттерджи А., Стоквелл П.А., Роджер Э.Дж. и Морисон И.М. 2012. Сравнение программного обеспечения для выравнивания данных полногеномных бисульфитных последовательностей. Исследования нуклеиновых кислот 40(10): e79.
  2. ^ Jump up to: а б с Фрага М.Ф., Эстеллер М. (сентябрь 2002 г.). «Метилирование ДНК: профиль методов и приложений» . БиоТехники . 33 (3): 632, 634, 636–49. дои : 10.2144/02333rv01 . ПМИД   12238773 .
  3. ^ Эль-Маарри О (2003). «Методы: метилирование ДНК». Пероксисомальные расстройства и регуляция генов . Достижения экспериментальной медицины и биологии. Том. 544. стр. 197–204. дои : 10.1007/978-1-4419-9072-3_23 . ISBN  978-0-306-48174-1 . ПМИД   14713229 .
  4. ^ Лэрд П.В. (апрель 2003 г.). «Сила и перспективы маркеров метилирования ДНК». Обзоры природы. Рак . 3 (4): 253–66. дои : 10.1038/nrc1045 . ПМИД   12671664 . S2CID   19574628 .
  5. ^ Jump up to: а б Каллинан П.А., Файнберг А.П. (апрель 2006 г.). «Новая наука эпигеномика» . Молекулярная генетика человека . 15 Спецификация № 1 (90001): R95-101. дои : 10.1093/hmg/ddl095 . ПМИД   16651376 .
  6. ^ Jump up to: а б Фроммер М., Макдональд Л.Е., Миллар Д.С., Коллис С.М., Уотт Ф., Григг Г.В. и др. (март 1992 г.). «Протокол геномного секвенирования, который дает положительное отображение остатков 5-метилцитозина в отдельных цепях ДНК» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 89 (5): 1827–31. Бибкод : 1992PNAS...89.1827F . дои : 10.1073/pnas.89.5.1827 . ПМК   48546 . ПМИД   1542678 .
  7. ^ Колелла С., Шен Л., Баггерли К.А., Исса Дж.П., Крахе Р. (июль 2003 г.). «Чувствительный и количественный универсальный анализ метилирования сайтов CpG с помощью пиросеквенирования» . БиоТехники . 35 (1): 146–50. дои : 10.2144/03351md01 . ПМИД   12866414 .
  8. ^ Тост Дж., Данкер Дж., Гут И.Г. (июль 2003 г.). «Анализ и количественная оценка множественных положений переменных метилирования в CpG-островках методом пиросеквенирования» . БиоТехники . 35 (1): 152–6. дои : 10.2144/03351md02 . ПМИД   12866415 .
  9. ^ Вонг Х.Л., Бьюн Х.М., Кван Дж.М., Кампан М., Инглес С.А., Лэрд П.В., Ян А.С. (декабрь 2006 г.). «Быстрый и количественный метод анализа аллель-специфического метилирования ДНК» . БиоТехники . 41 (6): 734–9. дои : 10.2144/000112305 . ПМИД   17191619 .
  10. ^ Бьянко Т., Хасси Д., Добрович А. (1999). «Одноцепочечный конформационный анализ, чувствительный к метилированию (MS-SSCA): быстрый метод выявления и анализа метилирования» . Человеческая мутация . 14 (4): 289–93. doi : 10.1002/(SICI)1098-1004(199910)14:4<289::AID-HUMU3>3.0.CO;2-A . ПМИД   10502775 . S2CID   22814772 .
  11. ^ Войдач Т.К., Добрович А. (2007). «Плавление с высоким разрешением, чувствительное к метилированию (MS-HRM): новый подход к чувствительной и высокопроизводительной оценке метилирования» . Исследования нуклеиновых кислот . 35 (6): е41. дои : 10.1093/нар/gkm013 . ПМЦ   1874596 . ПМИД   17289753 .
  12. ^ Гонсалго М.Л., Джонс, Пенсильвания (июнь 1997 г.). «Быстрая количественная оценка различий метилирования в конкретных сайтах с использованием чувствительного к метилированию удлинения однонуклеотидного праймера (Ms-SNuPE)» . Исследования нуклеиновых кислот . 25 (12): 2529–31. дои : 10.1093/нар/25.12.2529 . ПМЦ   146734 . ПМИД   9171109 .
  13. ^ Ульманн К., Бринкманн А., Толиат М.Р., Риттер Х., Нюрнберг П. (декабрь 2002 г.). «Оценка потенциального эпигенетического биомаркера с помощью количественного анализа полиморфизма метил-одиночных нуклеотидов». Электрофорез . 23 (24): 4072–9. дои : 10.1002/elps.200290023 . ПМИД   12481262 . S2CID   43737807 .
  14. ^ Матин М.М., Баумер А., Хорнби Д.П. (октябрь 2002 г.). «Аналитический метод обнаружения различий метилирования в определенных хромосомных локусах с использованием удлинения праймера и обращенно-фазовой ВЭЖХ с ионными парами» . Человеческая мутация . 20 (4): 305–11. дои : 10.1002/humu.10118 . ПМИД   12325026 . S2CID   3178841 .
  15. ^ Эрих М., Нельсон М.Р., Станссенс П., Забо М., Лилоглу Т., Ксинарианос Г. и др. (ноябрь 2005 г.). «Количественный высокопроизводительный анализ закономерностей метилирования ДНК путем расщепления по основаниям и масс-спектрометрии» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 102 (44): 15785–90. Бибкод : 2005PNAS..10215785E . дои : 10.1073/pnas.0507816102 . ПМК   1276092 . ПМИД   16243968 .
  16. ^ Герман Ю.Г. , Графф Дж.Р., Мёханен С., Нелькин Б.Д., Байлин С.Б. (сентябрь 1996 г.). «ПЦР, специфичная для метилирования: новый ПЦР-анализ статуса метилирования островков CpG» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 93 (18): 9821–6. Бибкод : 1996PNAS...93.9821H . дои : 10.1073/pnas.93.18.9821 . ПМЦ   38513 . ПМИД   8790415 .
  17. ^ Идс К.А., Даненберг К.Д., Каваками К., Сальц Л.Б., Блейк С., Шибата Д. и др. (апрель 2000 г.). «MethyLight: высокопроизводительный анализ для измерения метилирования ДНК» . Исследования нуклеиновых кислот . 28 (8): 32е–0. дои : 10.1093/нар/28.8.e32 . ПМЦ   102836 . ПМИД   10734209 .
  18. ^ Рэнд К., Цюй В., Хо Т., Кларк С.Дж. , Моллой П. (июнь 2002 г.). «Специфическое для конверсии обнаружение метилирования ДНК с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени (ConLight-MSP) во избежание ложноположительных результатов». Методы . 27 (2): 114–20. дои : 10.1016/S1046-2023(02)00062-2 . ПМИД   12095268 .
  19. ^ Акей Д.Т., Акей Дж.М., Чжан К., Джин Л. (октябрь 2002 г.). «Анализ метилирования ДНК на основе высокопроизводительных подходов к кривой плавления». Геномика . 80 (4): 376–84. дои : 10.1006/geno.2002.6851 . ПМИД   12376091 .
  20. ^ Кристенсен Л.С., Микеска Т., Крипуй М., Добрович А. (апрель 2008 г.). «Чувствительный анализ плавления после ПЦР, специфичной для метилирования в реальном времени (SMART-MSP): высокопроизводительное и беззондовое количественное обнаружение метилирования ДНК» . Исследования нуклеиновых кислот . 36 (7): е42. дои : 10.1093/нар/gkn113 . ПМК   2367707 . ПМИД   18344521 .
  21. ^ Адорьян П., Дистлер Дж., Липшер Э., Модель F, Мюллер Дж., Пелет С. и др. (март 2002 г.). «Прогнозирование и обнаружение классов опухолей с помощью анализа метилирования ДНК на основе микрочипов» . Исследования нуклеиновых кислот . 30 (5): 21д–21. дои : 10.1093/nar/30.5.e21 . ПМК   101257 . ПМИД   11861926 .
  22. ^ Тахилиани М., Ко К.П., Шен Ю., Пастор В.А., Бандуквала Х., Брудной И. и др. Преобразование 5-метилцитозина в 5-гидроксиметилцитозин в ДНК млекопитающих партнером MLL TET1 . Наука . 2009;324(5929):930-5.
  23. ^ Криауционис С., Хайнц Н. Основание ядерной ДНК 5-гидроксиметилцитозин присутствует в нейронах Пуркинье и головном мозге. Science.2009;324(5929):929-30.
  24. ^ Jump up to: а б Хуан Ю, Пастор В.А., Шен Ю, Тахилиани М, Лю Д.Р., Рао А. Поведение 5-гидроксиметилцитозина при бисульфитном секвенировании. PLOS ONE.2010;5(1):e8888 .
  25. ^ Ю, М., Хон, Г.К., Зулвак, К.Э., Сонг, К., Джин, П., Рен, Б., Хе, К. Бисульфитное секвенирование 5-гидроксиметилцитозина с помощью Tet. Нат. Протоколы 2012 , 7 , 2159.
  26. ^ Олек А., Освальд Дж., Уолтер Дж. (декабрь 1996 г.). «Модифицированный и улучшенный метод анализа метилирования цитозина на основе бисульфита» . Исследования нуклеиновых кислот . 24 (24): 5064–6. дои : 10.1093/нар/24.24.5064 . ПМК   146326 . ПМИД   9016686 .
  27. ^ Нидерхут, Чад Э.; Бьюик, Адам Дж.; Цзи, Лесян; Алабади, Мэгди С.; Ким, Кён До; Ли, Цин; Рор, Николас А.; Рамбани, Адити; Берк, Джон М.; Удалл, Джошуа А.; Эгези, Кьедози; Шмутц, Джереми; Гримвуд, Джейн; Джексон, Скотт А.; Спрингер, Натан М. (27 сентября 2016 г.). «Широко распространенное естественное изменение метилирования ДНК у покрытосеменных растений» . Геномная биология . 17 (1): 194. дои : 10.1186/s13059-016-1059-0 . ISSN   1474-760X . ПМК   5037628 .
  28. ^ Грунау С., Кларк С.Дж., Розенталь А. (июль 2001 г.). «Бисульфитное геномное секвенирование: систематическое исследование критических экспериментальных параметров» . Исследования нуклеиновых кислот . 29 (13): Е65-5. дои : 10.1093/нар/29.13.e65 . ПМЦ   55789 . ПМИД   11433041 .
  29. ^ Jump up to: а б Эрих М., Золл С., Сур С., ван ден Бум Д. (2007). «Новый метод точной оценки качества ДНК после обработки бисульфитом» . Исследования нуклеиновых кислот . 35 (5): е29. дои : 10.1093/nar/gkl1134 . ПМК   1865059 . ПМИД   17259213 .
  30. ^ Готро, Изабель (29 сентября 2014 г.). «NEBNext End Prep Mix v1» . протоколы.io . doi : 10.17504/protocols.io.cg4tyv . Проверено 19 мая 2021 г.
  31. ^ Эстеллер М. (июнь 2006 г.). «Необходимость проекта эпигенома человека» . Канцерогенез . 27 (6): 1121–5. дои : 10.1093/carcin/bgl033 . ПМИД   16699174 .
  32. ^ Jump up to: а б Брэдбери Дж. (декабрь 2003 г.). «Проект эпигенома человека запущен и работает» . ПЛОС Биология . 1 (3): Е82. doi : 10.1371/journal.pbio.0000082 . ПМК   300691 . ПМИД   14691553 .
  33. ^ Jump up to: а б Джонс П.А., Мартиенсен Р. (декабрь 2005 г.). «План проекта эпигенома человека: семинар AACR по эпигеному человека» . Исследования рака . 65 (24): 11241–6. дои : 10.1158/0008-5472.CAN-05-3865 . ПМИД   16357125 .
  34. ^ Гилихер П., Хартнетт Л., Иган Л.Дж., Голден А., Раджа Али Р.А., Сои С. (август 2013 г.). «Анализ набора генов сильно искажается, когда применяется к данным по полногеномному метилированию» . Биоинформатика . 29 (15): 1851–7. doi : 10.1093/биоинформатика/btt311 . ПМИД   23732277 .
  35. ^ Бут М.Дж., Бранко М.Р., Фиц Г., Оксли Д., Крюгер Ф., Рейк В. и др. количественное секвенирование 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина с одноосновным разрешением. Наука. 2012;336(6083):934-7 .
[ редактировать ]
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Bisulfite_sequencing&oldid=1194413355"
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: ac61f49e67b6cf2ff780e249119472ce__1704740340
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/ac/ce/ac61f49e67b6cf2ff780e249119472ce.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Bisulfite sequencing - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)