Комбинированный бисульфитрестрикционный анализ
Комбинированный бисульфитный рестрикционный анализ (или COBRA ) представляет собой метод молекулярной биологии, который позволяет проводить чувствительную количественную оценку уровней метилирования ДНК в определенном геномном локусе последовательности ДНК в небольшом образце геномной ДНК. [ 1 ] Этот метод представляет собой разновидность бисульфитного секвенирования и сочетает в себе конверсии бисульфита на основе полимеразную цепную реакцию с рестрикционным расщеплением . Первоначально разработанный для надежной обработки небольших количеств геномной ДНК из микропрепарированных образцов тканей, залитых в парафин , с тех пор этот метод нашел широкое применение в исследованиях рака и эпигенетических исследованиях. [ 2 ]
Процедура
[ редактировать ]Бисульфитная обработка
[ редактировать ]Представляющую интерес геномную ДНК обрабатывают бисульфитом натрия , что приводит к различиям в последовательностях, зависящих от метилирования. Во время обработки бисульфитом натрия неметилированные остатки цитозина превращаются в урацил , тогда как метилированные остатки цитозина не затрагиваются.
ПЦР-амплификация
[ редактировать ]
Затем ДНК, обработанная бисульфитом, амплифицируется с помощью ПЦР, в результате чего образуются остатки цитозина в первоначально метилированных положениях и остатки тимина в исходно неметилированных положениях (которые были преобразованы в урацил). Праймеры, используемые на этом этапе, не содержат сайтов CpG (общей мишени метилирования цитозина), поэтому процесс амплификации не различает матрицы на основе статуса метилирования. Продукты ПЦР очищаются для обеспечения полного расщепления на следующем этапе.
Дайджест ограничений
[ редактировать ]Вышеуказанные шаги приводят к зависимому от метилирования сохранению или потере сайтов рестриктаз , содержащих CpG , таких как сайты TaqI (TCGA) и BstUI (CGCG), в зависимости от того, был ли остаток цитозина первоначально метилирован или нет, соответственно. Благодаря независимой от метилирования амплификации на вышеуказанном этапе полученные продукты ПЦР будут представлять собой смешанную популяцию фрагментов, которые потеряли или сохранили CpG-содержащие сайты рестриктазы, соответствующие проценты которых будут напрямую коррелировать с исходным уровнем метилирования ДНК в образец ДНК.
Затем продукты ПЦР обрабатываются ферментом рестрикции ( например, BstUI), который расщепляет только первоначально метилированные сайты (CGCG), оставляя при этом сайты, которые изначально неметилированы (TGTG). Чтобы гарантировать, что все сайты CpG сохраняются из-за первоначального метилирования, а не являются остатками неполного преобразования бисульфита, выполняется контрольное расщепление с помощью таких ферментов, как Hsp92II , который распознает последовательность CATG, ни один из которых не должен оставаться после преобразования бисульфита ( за редким исключением метилирования, не связанного с CpG), и, таким образом, расщепление не должно происходить, если преобразование бисульфита было завершено.
Количественная оценка
[ редактировать ]Переваренные фрагменты затем разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле с ожидаемым появлением полос, соответствующих одному большому непереваренному фрагменту, и множества меньших полос, соответствующих расщепленным фрагментам. Количественное количество ДНК в этих полосах можно определить с помощью такого устройства, как фосфоимиджер , после чего процент метилирования исходного образца можно рассчитать по формуле:
Использование и приложения
[ редактировать ]COBRA широко использовалась во многих исследовательских приложениях, таких как скрининг изменений метилирования ДНК на промоторах генов в исследованиях рака, [ 3 ] [ 4 ] обнаружение измененных паттернов метилирования в импринтированных генах , [ 5 ] и характеристика закономерностей метилирования в геноме во время развития млекопитающих. [ 6 ] [ 7 ]
В медицине COBRA используется как инструмент для диагностики заболеваний человека, связанных с аберрантным метилированием ДНК. Исследователи использовали COBRA в сочетании с денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографией для диагностики генетического импринтинга синдрома Рассела-Сильвера , при котором гипометилирование импринтированного гена H19 ответственно за расстройство у 50% пациентов. [ 8 ]
Сильные стороны
[ редактировать ]- Просто, быстро и недорого : в COBRA уровни метилирования ДНК легко и быстро измеряются без необходимости трудоемкого субклонирования и секвенирования , как при бисульфитном секвенировании. Анализ прост и может быть выполнен с использованием стандартных недорогих реагентов для молекулярной биологии.
- Высокая совместимость : благодаря этапам ПЦР и очистки метод работает не только с очень небольшими количествами геномной ДНК, но и с образцами, обработанными парафином, что может вызвать проблемы в других протоколах количественного определения метилирования ДНК, таких как Саузерн-блоттинг. и расщепление чувствительным к метилированию рестрикционным ферментом с последующей ПЦР.
- Количественный : в отличие от ПЦР, специфичной для метилирования , которая является качественной. С помощью COBRA уровни метилирования ДНК можно напрямую определить количественно в данном локусе, что дает больше информации для каждого анализа.
- Масштабируемость для высокопроизводительной обработки образцов : с помощью COBRA многие интересующие области могут обрабатываться параллельно в отдельных образцах, расщепляемых одним и тем же ферментом рестрикции. В этом отличие от анализа бисульфитного секвенирования, при котором каждый регион необходимо тщательно изучить путем секвенирования множества клонов на локус, что требует больше времени.
- Несколько запросов на анализ . Статус метилирования можно проверить на нескольких сайтах рестрикции, содержащих CpG, в одном анализе расщепления.
Слабые стороны
[ редактировать ]- Анализ ограничен использованием существующих сайтов рестрикции в интересующей области, и метилирование, которое не происходит в контексте конкретного сайта рестрикции, анализироваться не будет.
- Неполное переваривание ферментами рестрикции после ПЦР может исказить анализ: неполное переваривание может указывать на отсутствие метилирования ДНК (при разрезании чувствительным к метилированию ферментом, таким как HpaII). Также известно, что BstUI может разрезать неконвертированные сайты, что приводит к завышению уровней метилирования, поэтому часто необходимо использование HpaII. [ 9 ]
- В сложных образцах гетерогенность типов клеток может затруднить анализ , поскольку ДНК не секвенируется, гетерогенность последовательностей из разных клеток в образце ( т. е. разных популяций клеток в опухоли), которые приобрели мутации в исследуемой области, такие как изменение динуклеотид CG на CA или CT приведет к потере сайта рестрикции, что приведет к образованию явно метилированной области из-за отсутствия переваривания. Это исказило бы количественную оценку уровней метилирования ДНК в данном образце.
Альтернативы
[ редактировать ]В общем, COBRA часто комбинируется с другими анализами метилирования ДНК и часто используется при первоначальном скрининге интересующих локусов. Если COBRA предложит измененные закономерности метилирования, то можно будет применить более строгие и трудоемкие методы, такие как бисульфитное секвенирование или MeDIP . Также секвенирование PacBio можно использовать для обнаружения метилирования ДНК.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Сюн, Чжэнган; Лэрд, Питер В. (1997). «COBRA: чувствительный и количественный анализ метилирования ДНК» . Исследования нуклеиновых кислот . 25 (12): 2532–2534. дои : 10.1093/нар/25.12.2532 . ПМК 146738 . ПМИД 9171110 .
- ^ Лэрд, Питер В. (2003). «Сила и перспективы маркеров метилирования ДНК». Обзоры природы Рак . 3 (апрель): 253–266. дои : 10.1038/nrc1045 . ПМИД 12671664 . S2CID 19574628 . , по состоянию на 2–11 февраля на эту статью было 576 ссылок. По данным Scopus
- ^ Шен, Ланлан; и др. (2005). «Метилирование промотора MGMT и дефект поля при спорадическом колоректальном раке». Журнал Национального института рака . 97 (18): 1330–1338. CiteSeerX 10.1.1.536.6096 . дои : 10.1093/jnci/dji275 . ПМИД 16174854 .
- ^ Сутер, Кэтрин, М.; и др. (2004). «Эпимутация зародышевой линии MLH1 у людей с множественным раком» . Природная генетика . 36 (5): 497–501. дои : 10.1038/ng1342 . ПМИД 15064764 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Блик, Джет; и др. (2009). «Гипометилирование в нескольких материнских метилированных импринтированных областях, включая локусы PLAGL1 и GNAS при синдроме Беквита-Видемана, и характеристика закономерностей метилирования ДНК в геноме во время развития у млекопитающих» (PDF) . Европейский журнал генетики человека . 17 (5): 611–618. дои : 10.1038/ejhg.2008.233 . ПМК 2986258 . ПМИД 19092779 .
- ^ Верниг, Мариус; и др. (2007). «Перепрограммирование фибробластов in vitro в плюрипотентное состояние, подобное ES-клеткам». Природа . 448 (7151): 318–324. Бибкод : 2007Natur.448..318W . дои : 10.1038/nature05944 . ПМИД 17554336 . S2CID 4377572 .
- ^ Миккельсен, Тарьей С.; и др. (2008). «Раскрытие прямого перепрограммирования посредством интегративного геномного анализа» . Природа . 454 (июль): 49–56. Бибкод : 2008Natur.454...49M . дои : 10.1038/nature07056 . ПМЦ 2754827 . ПМИД 18509334 .
- ^ Хаттори, М.; и др. (2009). «Диагностика синдрома Рассела-Сильвера с помощью комбинированного анализа бисульфитной рестрикции и денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии». Генетическое тестирование и молекулярные биомаркеры . 13 (5): 623–630. дои : 10.1089/gtmb.2009.0018 . ПМИД 19814617 .
- ^ Фрага, Марио Ф.; Эстеллер, Манель (2002). «Метилирование ДНК: профиль методов и приложений» . БиоТехники . 33 (3): 633–649. дои : 10.2144/02333rv01 . ПМИД 12238773 .