Дидезоксинуклеотид

Дидезоксинуклеотиды — это ингибиторы удлинения цепи ДНК-полимеразы , используемые в методе Сэнгера для секвенирования ДНК . ^{[ 1 ]} Они также известны как 2',3', поскольку в положениях 2' и 3' рибозы отсутствуют гидроксильные группы , и сокращенно обозначаются как ddNTP (ddGTP, ddATP, ddTTP и ddCTP). ^{[ 2 ]}

Роль в методе Сэнгера

Метод Сэнгера используется для амплификации целевого сегмента ДНК, чтобы можно было точно определить последовательность ДНК. Включение ddNTP в реакционные клапаны просто используется для прекращения синтеза растущей цепи ДНК, что приводит к частично реплицированным фрагментам ДНК. Это связано с тем, что ДНК-полимераза требует 3'-ОН-группы растущей цепи и 5'-фосфатной группы поступающего dNTP для создания фосфодиэфирной связи . ^{[ 2 ]} Иногда ДНК-полимераза включает ddNTP, и отсутствие 3'-ОН-группы прерывает реакцию конденсации между 5'-фосфатом (после расщепления пирофосфата ) входящего нуклеотида с 3'-гидроксильной группой предыдущего нуклеотида на растущая прядь. Эта реакция конденсации обычно происходит при включении немодифицированного dNTP ДНК-полимеразой. Проще говоря, нуклеофильная атака 3'-ОН-группы приводит к присоединению нуклеотида к растущей цепи. Отсутствие 3'-гидроксильной группы препятствует этой нуклеофильной атаке, отключая способность ДНК-полимеразы продолжать свою функцию. ^{[ 2 ]}

Это открытие привело к соответствующему названию «Нуклеотиды, обрывающие цепь». ^{[ 2 ]} Дидезоксирибонуклеотиды не имеют 3'-гидроксильной группы, поэтому дальнейшее удлинение цепи не может происходить, когда этот дидезоксинуклеотид находится в цепи. Это может привести к обрыву последовательности ДНК. Таким образом, эти молекулы составляют основу обрывом дидезоксицепи с метода секвенирования ДНК , о котором сообщили Фредерик Сэнгер и его команда в 1977 году. ^{[ 3 ]} как продолжение предыдущей работы. ^{[ 4 ]} Подход Сэнгера был описан в 2001 году как один из двух фундаментальных методов секвенирования фрагментов ДНК. ^{[ 1 ]} (второй - метод Максама – Гилберта ^{[ 5 ]}), но метод Сэнгера является одновременно «наиболее широко используемым и методом, используемым большинством автоматических секвенаторов ДНК». ^{[ 1 ]} Сэнгер получил свою вторую Нобелевскую премию по химии в 1980 году, разделив ее с Уолтером Гилбертом («за вклад в определение последовательностей оснований нуклеиновых кислот») и Полем Бергом («за фундаментальные исследования биохимии нуклеиновых кислот, с особое внимание к рекомбинантной ДНК ») ^{[ 6 ]} и обсудил использование дидезоксинуклеотидов в своей Нобелевской лекции. ^{[ 7 ]}

Секвенирование ДНК

Дидезоксинуклеотиды полезны при секвенировании ДНК в сочетании с электрофорезом . Образец ДНК, подвергнутый ПЦР ( полимеразной цепной реакции ) в смеси, содержащей все четыре дезоксинуклеотида и один дидезоксинуклеотид, образует цепи длиной, равной положению каждого основания типа, который дополняет тип, в котором присутствует дидезоксинуклеотид. То, что taq-полимераза, используемая в ПЦР, благоприятствует ddGNTP, является закономерностью, наблюдаемой в различных исследованиях. ^{[ 8 ]} То есть каждое нуклеотидное основание этого конкретного типа имеет вероятность быть связано не с дезоксинуклеотидом, а с дидезоксинуклеотидом, что завершает удлинение цепи. Следовательно, если образец затем подвергнется электрофорезу, для каждой длины будет присутствовать полоса, на которой присутствует комплемент дидезоксинуклеотида. В настоящее время принято использовать флуоресцентные дидезоксинуклеотиды, так что каждый из четырех имеет различную флуоресценцию, которую можно обнаружить с помощью секвенатора; таким образом, необходима только одна реакция.

Производство

В запатентованном методе Тетрагидрофуран использовался в растворителе, содержащем 50 г (0,205 моль) уридина (или, предположительно, любого незащищенного нуклеозида ), 112 мл (1,03 моль) метилортоформиата и 10 г (52,6 ммоль) паратолуолсульфокислоты при комнатной температуры при перемешивании. После перемешивания при комнатной температуре в течение 24 часов реакционную смесь выливали в водный раствор бикарбоната натрия с последующей экстракцией хлороформом 5 раз. Экстракт сушили над сульфатом натрия и концентрировали, получая 49,5 г (0,173 моль) 2',3'-о-метоксиметилиденневридина (выход 84,5%). После этой реакции продукт примера уридина 2',3'-о-метоксиметилиневридин затем растворяют в 50 мл уксусного ангидрида при комнатной температуре и перемешивании. Раствор нагревали до 140°С. и выдерживали при этой температуре в течение 5 часов при кипении растворителя с обратным холодильником. После охлаждения до комнатной температуры растворитель удаляли перегонкой при пониженном давлении, добавляли 50 мл воды и смесь экстрагировали 3 раза по 100 мл хлороформа. Экстракт концентрировали при пониженном давлении с использованием 30% аммиачной воды с получением 82,3% выхода 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидроуридина. Этот пример продукта затем гидратируют для удаления двойной связи путем его растворения в метаноле (10 мл), содержащем катализатор (влажный 5% палладий на угле) (400 мг), в атмосфере водорода в течение 1 часа с получением полученного дидезоксинуклеозида ( 2 ',3'-дидезоксиуридин в данном случае). ^{[ 6 ]} красителя Нуклеотид , который будет использоваться, вероятно, будет получен в результате обработки ферментом фосфорилирования, биотинилирования и реакции биотинилированного вещества с красителем. Вполне возможно, что также может произойти немедленная реакция с красителем, но утверждается, что удлинение плеча увеличивает эффективность в случае использования мутантной формы ДНК-полимеразы. ^{[ 5 ]}

Ссылки

^ Перейти обратно: ^а ^б ^с Мейс Р.Дж., Рагхавачари Р. (2001). «Применение ближнего инфракрасного диапазона в секвенировании и анализе ДНК» . В Рагхавачари Р. (ред.). Применение ближнего инфракрасного диапазона в биотехнологии . ЦРК Пресс . стр. 133–150. ISBN 9781420030242 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д Уотсон Дж.Д., Бейкер Т.А., Белл С.П., Ганн А., Левин М., Лосик Р. (2014). Молекулярная биология гена (7-е изд.). Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Пирсон. стр. 160–161. ISBN 978-0-321-76243-6 .
^ Сэнгер Ф. , Никлен С., Коулсон А.Р. (декабрь 1977 г.). «Секвенирование ДНК с ингибиторами обрыва цепи» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 74 (12): 5463–7. Бибкод : 1977PNAS...74.5463S . дои : 10.1073/pnas.74.12.5463 . ПМК 431765 . ПМИД 271968 .
^ Сэнгер Ф. , Коулсон А.Р. (май 1975 г.). «Быстрый метод определения последовательностей ДНК путем синтеза с помощью ДНК-полимеразы». Журнал молекулярной биологии . 94 (3): 441–8. дои : 10.1016/0022-2836(75)90213-2 . ПМИД 1100841 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Максам А.М. , Гилберт В. (февраль 1977 г.). «Новый метод секвенирования ДНК» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 74 (2): 560–4. Бибкод : 1977ПНАС...74..560М . дои : 10.1073/pnas.74.2.560 . ПМК 392330 . ПМИД 265521 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Kungliga Vetenskapsakademien (Шведская королевская академия наук) (14 октября 1980 г.). «Нобелевская премия по химии 1980 года» . nobelprize.org (пресс-релиз). Нобель Медиа . Архивировано из оригинала 31 октября 2018 года . Проверено 14 декабря 2019 г.
^ Сэнгер, Ф. (8 декабря 1980 г.). «Определение нуклеотидных последовательностей в ДНК (Нобелевская лекция)» (PDF) . nobelprize.org . Нобель Медиа . Архивировано (PDF) из оригинала 14 декабря 2019 года . Проверено 14 декабря 2019 г.
^ Ли Ю, Митаксов В, Ваксман Г (август 1999 г.). «Структурный дизайн ДНК-полимераз Taq с улучшенными свойствами включения дидезоксинуклеотидов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 96 (17): 9491–6. Бибкод : 1999PNAS...96.9491L . дои : 10.1073/pnas.96.17.9491 . ПМК 22236 . ПМИД 10449720 .

Внешние ссылки

СМИ, связанные с дидезоксинуклеотидами, на Викискладе?

[MeisRaghavachari-1] Перейти обратно: ^а ^б ^с Мейс Р.Дж., Рагхавачари Р. (2001). «Применение ближнего инфракрасного диапазона в секвенировании и анализе ДНК» . В Рагхавачари Р. (ред.). Применение ближнего инфракрасного диапазона в биотехнологии . ЦРК Пресс . стр. 133–150. ISBN 9781420030242 .

[Watson_2014-2] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д Уотсон Дж.Д., Бейкер Т.А., Белл С.П., Ганн А., Левин М., Лосик Р. (2014). Молекулярная биология гена (7-е изд.). Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Пирсон. стр. 160–161. ISBN 978-0-321-76243-6 .

[3] Сэнгер Ф. , Никлен С., Коулсон А.Р. (декабрь 1977 г.). «Секвенирование ДНК с ингибиторами обрыва цепи» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 74 (12): 5463–7. Бибкод : 1977PNAS...74.5463S . дои : 10.1073/pnas.74.12.5463 . ПМК 431765 . ПМИД 271968 .

[4] Сэнгер Ф. , Коулсон А.Р. (май 1975 г.). «Быстрый метод определения последовательностей ДНК путем синтеза с помощью ДНК-полимеразы». Журнал молекулярной биологии . 94 (3): 441–8. дои : 10.1016/0022-2836(75)90213-2 . ПМИД 1100841 .

[:0-5] Перейти обратно: ^а ^б Максам А.М. , Гилберт В. (февраль 1977 г.). «Новый метод секвенирования ДНК» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 74 (2): 560–4. Бибкод : 1977ПНАС...74..560М . дои : 10.1073/pnas.74.2.560 . ПМК 392330 . ПМИД 265521 .

[:1-6] Перейти обратно: ^а ^б Kungliga Vetenskapsakademien (Шведская королевская академия наук) (14 октября 1980 г.). «Нобелевская премия по химии 1980 года» . nobelprize.org (пресс-релиз). Нобель Медиа . Архивировано из оригинала 31 октября 2018 года . Проверено 14 декабря 2019 г.

[7] Сэнгер, Ф. (8 декабря 1980 г.). «Определение нуклеотидных последовательностей в ДНК (Нобелевская лекция)» (PDF) . nobelprize.org . Нобель Медиа . Архивировано (PDF) из оригинала 14 декабря 2019 года . Проверено 14 декабря 2019 г.

[8] Ли Ю, Митаксов В, Ваксман Г (август 1999 г.). «Структурный дизайн ДНК-полимераз Taq с улучшенными свойствами включения дидезоксинуклеотидов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 96 (17): 9491–6. Бибкод : 1999PNAS...96.9491L . дои : 10.1073/pnas.96.17.9491 . ПМК 22236 . ПМИД 10449720 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]