Секвенирование Максама-Гилберта
Секвенирование Максама-Гилберта — это метод секвенирования ДНК, разработанный Алланом Максамом и Уолтером Гилбертом в 1976–1977 годах. Этот метод основан на нуклеиновых оснований частичной химической модификации ДНК, специфичной для , и последующем расщеплении остова ДНК в участках, прилегающих к модифицированным нуклеотидам . [1]
Секвенирование Максама-Гилберта было первым широко распространенным методом секвенирования ДНК и, наряду с дидезокси-методом Сэнгера , представляет собой первое поколение методов секвенирования ДНК. Секвенирование Максама-Гилберта больше не используется широко, его вытесняют методы секвенирования следующего поколения .
История
[ редактировать ]Хотя Максам и Гилберт опубликовали свой метод химического секвенирования через два года после того, как Фредерик Сэнгер и Алан Коулсон опубликовали свою работу по плюс-минусному секвенированию, [2] [3] Секвенирование Максама-Гилберта быстро стало более популярным, поскольку очищенную ДНК можно было использовать напрямую, в то время как первоначальный метод Сэнгера требовал, чтобы каждое начало считывания клонировалось для получения одноцепочечной ДНК. Однако с усовершенствованием метода обрыва цепи (см. ниже) секвенирование Максама-Гилберта потеряло популярность из-за своей технической сложности, запрещающей его использование в стандартных наборах для молекулярной биологии, широкого использования опасных химических веществ и трудностей с масштабированием. вверх. [4]
Статья Аллана Максама и Уолтера Гилберта 1977 года «Новый метод секвенирования ДНК» была удостоена награды «Citation for Chemical Breakthrough» от Отдела истории химии Американского химического общества за 2017 год. Она была вручена Департаменту молекулярной и клеточной биологии. , Гарвардский университет. [5]
Процедура
[ редактировать ]Секвенирование Максама-Гилберта требует радиоактивной метки на одном 5'-конце секвенируемого фрагмента ДНК (обычно с помощью киназной реакции с использованием гамма-конца). 32 P АТФ ) и очистка ДНК. Химическая обработка приводит к разрывам небольшой части одного или двух из четырех нуклеотидных оснований в каждой из четырех реакций (G, A+G, C, C+T). Например, пурины (A+G) депуринируются с помощью муравьиной кислоты , гуанины (и в некоторой степени аденины ) метилируются диметилсульфатом , а пиримидины (C+T) гидролизуются с помощью гидразина . Добавление соли ( хлорида натрия ) к реакции гидразина ингибирует реакцию тимина по реакции только С. Модифицированные ДНК затем можно расщепить горячим пиперидином ; (CH 2 ) 5 NH в положении модифицированного основания. Концентрацию модифицирующих химикатов контролируют так, чтобы в среднем внести одну модификацию на молекулу ДНК. Таким образом генерируется серия меченых фрагментов, от меченого радиоактивным изотопом конца до первого «разрезанного» сайта в каждой молекуле.
Фрагменты в четырех реакциях подвергают электрофорезу рядом в денатурирующих акриламидных гелях для разделения по размерам. Чтобы визуализировать фрагменты, гель подвергается рентгеновской пленке для авторадиографии , в результате чего образуется ряд темных полос, каждая из которых показывает расположение идентичных меченных радиоактивным изотопом молекул ДНК. По наличию и отсутствию определенных фрагментов можно судить о последовательности. [1] [6]
Связанные методы
[ редактировать ]Этот метод привел к созданию анализа интерференции метилирования, используемого для картирования сайтов связывания ДНК с ДНК-связывающими белками . [7]
Протокол автоматизированного секвенирования Максама-Гилберта был разработан в 1994 году. [8]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Максам А.М., Гилберт В. (февраль 1977 г.). «Новый метод секвенирования ДНК» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 74 (2): 560–4. Бибкод : 1977ПНАС...74..560М . дои : 10.1073/pnas.74.2.560 . ПМК 392330 . ПМИД 265521 .
- ^ Сэнгер Ф., Коулсон А.Р. (май 1975 г.). «Быстрый метод определения последовательностей ДНК путем синтеза с помощью ДНК-полимеразы». Дж. Мол. Биол . 94 (3): 441–8. дои : 10.1016/0022-2836(75)90213-2 . ПМИД 1100841 .
- ^ Сэнгер Ф. Определение нуклеотидных последовательностей в ДНК . Нобелевская лекция, 8 декабря 1980 г.
- ^ Грациано Пезоле; Сесилия Сакконе (2003). Справочник сравнительной геномики: принципы и методология . Нью-Йорк: Вили-Лисс. п. 133. ИСБН 0-471-39128-Х .
{{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ «Награды лауреатам премии Chemical Breakthrough Awards 2017» . Отдел истории химии . Проверено 12 марта 2018 г.
- ^ «Протоколы Колд-Спринг-Харбор - химическое секвенирование» .
- ^ «Протоколы Колд-Спринг-Харбор - анализ помех метилирования» .
- ^ Боланд, Э.Дж.; Пиллаи, А; Одом, Миссури; Джагадисваран, П. (июнь 1994 г.). «Автоматизация реакций химического секвенирования Максама-Гилберта». БиоТехники . 16 (6): 1088–92, 1094–5. PMID 8074875 .